JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر النقش التقويمي لخلايا سرطان المبيض الممزوجة بالخلايا اللحمية البشرية نموذجا للفأر يظهر سلوكا نقيليا سريعا ومنتشرا من سمات سرطان المبيض البشري. يسمح هذا النموذج أيضا بدراسة تفاعلات الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية ، بالإضافة إلى دورها في تطور الورم ورم خبيث.

Abstract

يتميز سرطان المبيض بالورم الخبيث المبكر المنتشر حيث يعانين 70٪ من النساء من مرض نقيلي في وقت التشخيص. في حين أن نماذج الفئران المعدلة وراثيا الأنيقة لسرطان المبيض موجودة ، فإن هذه الفئران باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا لتطوير الأورام. تفتقر نماذج الحقن داخل الصفاق إلى السدى البشري ولا تصمم بدقة ورم خبيث لسرطان المبيض. حتى الطعوم الغريبة المشتقة من المريض (PDX) لا تلخص بشكل كامل البيئة المكروية اللحمية البشرية حيث تظهر مقاطع PDX التسلسلية خسارة كبيرة في السدى البشري. تعد القدرة على نمذجة سرطان المبيض البشري بسهولة داخل بيئة مكروية لحمية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية حاجة غير ملباة. هنا ، يقدم البروتوكول نموذجا لسرطان المبيض تقويم العظام باستخدام خلايا سرطان المبيض البشرية جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية الوسيطة المرتبطة بالسرطان المشتق من المريض (CA-MSCs). CA-MSCs هي خلايا سلفية لحمية ، والتي تقود تكوين البيئة المكروية اللحمية وتدعم نمو سرطان المبيض ورم خبيث. يتطور هذا النموذج مبكرا وينشر ورم خبيث يحاكي العرض السريري. في هذا النموذج ، يتم خلط لوسيفيراز الذي يعبر عن خلايا سرطان المبيض بنسبة 1: 1 مع CA-MSCs ويتم حقنه في الجراب المبيضي لفئران NSG. يتم متابعة نمو الورم والورم الخبيث بشكل متسلسل بمرور الوقت باستخدام التصوير الحيوي. تنمو الأورام الناتجة بقوة وتشكل نقائل في البطن بعد 14 يوما من الحقن. شهدت الفئران انخفاضا كبيرا في وزن الجسم كعلامة على المرض الجهازي وزيادة عبء المرض. بحلول اليوم 30 بعد الحقن ، استوفت الفئران معايير نقطة النهاية المتمثلة في فقدان وزن الجسم بنسبة >10٪ والتشريح المؤكد أن النقائل داخل البطن في 100٪ من الفئران و 60٪ -80٪ ورم خبيث في الرئة والكبد المتني. بشكل جماعي ، ينتج عن تقويم العظام لخلايا سرطان المبيض وخلايا السدى أورام تحاكي عن كثب السلوك النقيلي المبكر والمنتشر لسرطان المبيض البشري. علاوة على ذلك ، يوفر هذا النموذج أداة لدراسة دور خلية سرطان المبيض: تفاعلات خلايا السدى في التقدم النقيلي.

Introduction

سرطان المبيض هو مرض مميت مع5 أعلى معدل وفيات بين جميع أنواع السرطان لدى النساء1. يتم تشخيص معظم النساء المصابات بسرطان المبيض في مرحلة متقدمة ، مع وجود انتشار نقيلي في 70٪ من المرضى في وقت التشخيص. تساهم عوامل مثل النقائل المبكرة والمرحلة المتقدمة من التشخيص في ارتفاع معدلات الوفيات التي تظهر مع هذا المرض. علاوة على ذلك ، شكلت خصائص المرض الفريدة هذه تحديا لإنشاء نماذج فأر سرطان المبيض ، بما في ذلك إعادة إنتاج الهجرة السريعة للمرض إلى التجويف البريتوني2،3،4.

يتم تسهيل التسبب في سرطان المبيض ، بما في ذلك انتشار الصفاق ، من خلال تكوين بيئة مكروية داعمة للورم (TME) تشتمل على العديد من العناصر5. أحد المكونات الحاسمة لسرطان المبيض TME هو الخلايا الجذعية الوسيطة المرتبطة بالسرطان (CA-MSC). CA-MSCs هي خلايا سلفية لحمية تعزز بدء سرطان المبيض ونموه ومقاومة العلاج الكيميائي ورم خبيث6،7. تقود CA-MSCs أيضا تكوين سرطان المبيض TME من خلال تحفيز التليف المرتبط بالورم ، وإحداث تكوين الأوعية الدموية ، وتغيير البيئة المكروية المناعية6،8،9. بالنظر إلى الوظائف القوية ل CA-MSCs داخل سرطان المبيض TME ، فإن نمذجة سرطان المبيض البشري داخل بيئة مكروية لحمية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية أمر بالغ الأهمية في دراسة تطور سرطان المبيض ورم خبيث.

في الآونة الأخيرة ، اكتسبت نماذج الفئران المعدلة وراثيا جاذبية في دراسة النقائل العفوية لسرطان المبيض. ومع ذلك ، فإن الفئران المعدلة وراثيا مكلفة وتظهر مسارا زمنيا طويلا لتطور المرض النقيلي. في حين أن نماذج الفئران الأخرى المتاحة مثل النموذج داخل الصفاق والطعوم الغريبة المشتقة من المريض (PDX) لها فترات زمنية نقيلية قصيرة نسبيا ، إلا أنها لا تلخص نقائل سرطان المبيض بالكامل بسبب عدم وجود بيئة مكروية لحمية ذات صلة10،11،12. في محاولة للتغلب على هذا التحدي ، تقدم هذه الدراسة نموذجا لسرطان المبيض تقويم العظام باستخدام خلايا سرطان المبيض البشرية جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية الجذعية CA-المشتقة من المريض. في النموذج الموضح هنا ، يؤدي الجمع بين CA-MSCs وخلايا سرطان المبيض إلى توليد أورام ذات نقائل مبكرة ومنتشرة ، كما يتضح من وجود نقائل داخل البطن في 100٪ من الفئران في غضون 30 يوما بعد الحقن.

Protocol

تم الحصول على عينات من المرضى وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل IRB بجامعة بيتسبرغ (PRO17080326). تم إجراء الأساليب التجريبية على بموجب البروتوكول المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة بيتسبرغ.

1. عزل الخلايا الجذعية الوسيطة المرتبطة بالسرطان المشتق من المريض والتحقق من صحتها (CA-MSCs)

ملاحظة: CA-MSCs مشتقة من أنسجة سرطان المبيض البشري التي تم استئصالها جراحيا (تستخدم هذه الدراسة سرطان مصلي عالي الدرجة) ، بما في ذلك قناة فالوب و / أو المبيض و / أو الرواسب النقيلية العقلية. يتم تحضير وسط CA-MSC من MEBM (الوسط القاعدي للخلايا الظهارية الثديية) مكمل بنسبة 10٪ FBS معطل بالحرارة ، 1x B27 ، 20 نانوغرام / مل EGF ، 1 نانوغرام / مل هيدروكورتيزون ، 5 ميكروغرام / مل أنسولين ، 100 ميكرومتر β-ميركابتو إيثانول ، 10 نانوغرام / مل β-FGF ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 20 ميكروغرام / مل جنتاميسين7،13.

  1. عزل CA-MSC
    1. باستخدام مشرط معقم وملقط ، قسم عينة الأنسجة إلى قطع بحجم 1 مم3 تقريبا. ضع ثلاث قطع من الأنسجة في كل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار.
      ملاحظة: يمكن تقطيع 0.2 غرام من أنسجة الورم إلى 12 قطعة ويمكن توزيعها إلى أربعة آبار من لوحة ثقافة الخلايا المكونة من 6 آبار.
    2. أضف طبقة رقيقة من وسائط CA-MSC ، حوالي 1 مل لكل بئر. ضع لوحة زراعة الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    3. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسائط بعناية دون إزعاج قطع المناديل. أضف ما يقرب من 1 مل من الوسائط الجديدة إلى كل بئر. قم بضرب الوسائط ببطء دون إزعاج مرفقات الأنسجة. ضع لوحة زراعة الخلية مرة أخرى في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: افحص الأنسجة بمجهر مقلوب كل يوم وقم بتغيير الوسائط كما هو موضح في الخطوة 1.1.3 كلما تم تصور الخلايا الميتة في وسط المزرعة.
    4. بعد 7 أيام ، قم بإزالة قطع المناديل عن طريق التقاط الأنسجة باستخدام ملقط معقم وغسل الخلايا الملتصقة مرة واحدة باستخدام PBS (PBS بدون Ca2 + / Mg2+ ، 1 مل لكل بئر). بعد ذلك ، أضف وسط CA-MSC الطازج (2 مل لكل بئر) وضع لوحة زراعة الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. توسيع CA-MSCs
    1. عندما تبدأ الخلايا الجذعية الجذعية في النمو من الأنسجة داخل الصفيحة المكونة من 6 آبار ، افحص الخلايا بمجهر مقلوب كل يومين لضمان نمو الخلايا. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ ، تابع الخطوات التالية.
    2. استنشق الوسائط من لوحة زراعة الخلية ، ثم اغسل الخلايا مرة واحدة ب 1-2 مل من PBS لكل بئر (PBS بدون Ca2 + / Mg2+).
    3. أضف 300 ميكرولتر لكل بئر من محلول 0.05٪ تريبسين / 0.02٪ EDTA (التربسين / EDTA). قم بتدوير لوحة زراعة الخلايا لتغطية الخلايا بالتربسين / EDTA وأعد لوحة زراعة الخلية إلى الحاضنة لمدة 2-3 دقائق أو حتى يتم فصل الخلايا.
    4. أضف وسيطا جديدا ل CA-MSC لتعطيل التربسين (1 مل لكل بئر) وإعادة تعليق الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا بوسط النمو. انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى قارورة مقاس 25 سم2 بحجم إجمالي قدره 5 مل من وسائط الاستزراع.
      ملاحظة: يمكن نقل الخلايا التي تم جمعها من ثلاثة آبار من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبارإلى قارورة 2 مقاس 25 سم. يجب اختبار الخلايا بحثا عن وجود الميكوبلازما (باتباع بروتوكول الكشف عن الميكوبلازما المعمول به مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لأنها مشتقة من الأنسجة البشرية التي تم استئصالها جراحيا14،15.
    5. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 70٪ -80٪ من التقاء ، انقل الخلايا من قارورة 25 سم2 إلى قارورة 75 سم2 باتباع الخطوات الموضحة سابقا 1.2.2-1.2.4. قم بتوسيع الخلايا كل 5-7 أيام للحصول على رقم الخلية المطلوب للتحقق من صحة CA-MSC وإجراء التلقيح التقويمي.
      ملاحظة: نظرا لأن الخلايا الجذعية الجذعية CA-هي خلايا مشتقة من المريض ، فإن وقت مضاعفة الخلية يختلف بين خطوط الخلايا. تتطلب معظم CA-MSCs 3-4 أيام لمضاعفة العدد. ومع ذلك ، تتطلب بعض CA-MSCs 5-7 أيام لمضاعفة العدد. يمكن تمرير CA-MSCs من 8 إلى 10 مرات. بعد المرور 10 ، قد تتقدم الخلايا الجذعية الجذعية CA-تتغير أو تتمايز.
  3. التحقق من صحة CA-MSC
    1. التحقق من صحة التعبير السطحي CA-MSC: استخدم 0.5 × 106 CA-MSCs (حوالي 70٪ التقاء في قارورة 75 سم2 ) لتحليل قياس التدفق الخلوي للتأكد من أن CA-MSCs تعبر عن علامات السطح المناسبة على النحو المحدد في إرشادات الجمعية الدولية للعلاج الخلوي ، كما هو موضح سابقا (CD73 / CD90 / CD105 إيجابي ؛ CD45 / CD34 / CD14 أو CD11b / CD79a أو CD19 / HLA-DR سلبي) 7،16. تأكد من رقم الخلية بعد التربسين والعد باستخدام مقياس كثافة الدم مع استبعاد الخلايا الميتة باللون الترباني.
      ملاحظة: إذا أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن الخلايا نقية بنسبة <90٪ ، فقم بفرز الخلايا لمجموعة CA-MSC.
    2. التحقق من صحة تمايز CA-MSC: للتحقق من تمايز النسب ، قم ببذور CA-MSCs في بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار بكثافة خلية 5 × 104 خلايا / بئر في 2 مل من وسائط MSC (بئر واحد لكل حالة تمايز). بعد 24 ساعة ، قم بتغيير الوسائط إلى وسائط التمايز المناسبة للحث على تمايز الخلايا الشحمية مقابل الخلايا الغضروفية مقابل الخلايا العظمية كما هو موضح سابقا7،16.
      ملاحظة: وفقا لإرشادات ISCT ، يجب أن تظهر الخلايا الجذعية الجذعية التمايز في المختبر إلى خطين على الأقل (الخلايا الشحمية أو الخلايا الغضروفية أو الخلايا العظمية).
  4. في يوم إجراء حقن الفأر المخطط له ، اجمع الخلايا باتباع الخطوتين 1.2.2 و 1.2.4. بعد ذلك ، قم بحساب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم مع استبعاد التريبان الأزرق للبقاء وأعد تعليق الخلايا في وسط CA-MSC بكثافة 1 × 108 خلية / مل (0.5 × 106 CA-MSCs لكل حقنة). ضع الخلايا العالقة فوق الثلج.
    ملاحظة: بشكل عام ، يمكن اشتقاق ما لا يقل عن 1 × 107 CA-MSCs من عينة ورم واحدة (0.2 غرام من الأنسجة). يسمح ذلك باستخدام خط CA-MSC واحد مشتق من المريض في معظم تجارب الفئران. من الممكن الجمع بين الخلايا الجذعية الجذعية من مرضى مختلفين ، لكننا نوصي بأن تكون مشتقة من نفس النوع الفرعي النسيجي لسرطان المبيض. تستغرق معظم خطوط CA-MSCs شهرين و / أو 6-7 ممرات للوصول إلى 1 × 107 خلايا. يمكن تجميد الخلايا الجذعية الجذعية CA-باستخدام وسائط تجميد الخلايا القياسية وتخزينها في النيتروجين السائل إلى أجل غير مسمى لاستخدامها لاحقا.

2. تحضير خلايا سرطان المبيض

  1. الحفاظ على خلايا OVCAR3-Luc في وسط DMEM مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) والبنسلين / الستربتومايسين (البنسلين: 100 وحدة / مل ، الستربتومايسين: 0.1 مجم / مل). خلايا الزراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
  2. في يوم الحقن ، اجمع خلايا OVCAR3-Luc باستخدام الخطوات التالية.
    1. أولا ، قم بشفط الوسائط من قارورة زراعة الخلية واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 5-7 مل من PBS لكل قارورة 75 سم2 (PBS بدون Ca2 + / Mg2+). قم بشفط PBS وأضف محلول التربسين / EDTA (2 مل لكل قارورة 75 سم2 ). ثم أعد قارورة زراعة الخلية إلى الحاضنة لمدة 3-5 دقائق أو حتى تنفصل الخلايا.
    2. باستخدام الفحص المجهري ، تأكد من التربسين الكامل للخلايا (تأكد من فصل جميع الخلايا عن قارورة الثقافة). لوقف التربسين ، أضف DMEM الطازج المحتوي على المصل إلى القارورة (2-3 مل لكل قارورة 75 سم2 ) وأعد تعليق الخلايا. باستخدام ماصة ، انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا بوسط النمو. بعد ذلك ، عد الخلايا وأعد تعليقها في وسط النمو بكثافة 1 × 108 خلية / مل (0.5 × 106 خلايا OVCAR3-Luc لكل حقنة). ضع الخلايا العالقة فوق الثلج.

3. التلقيح التقويمي

  1. تحضير تعليق الخلية
    1. امزج خلايا CA-MSCs و OVCAR-Luc بنسبة 1: 1.
    2. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي المجمدة في حمام جليدي. بعد ذلك ، أضف تعليق الخلية المحضر في الخطوة 3.1.1 إلى مصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 1: 1 (التركيز النهائي للخلية: 1 × 106/20 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي المتوسط) واخلطه جيدا. يجب حفظ معلقات الخلية المحضرة في حمام جليدي حتى الاستخدام.
      ملاحظة: الموصوفة هنا هي نسبة 1: 1 CA-MSC إلى OVCAR-Luc بناء على الخبرة السابقة مع النموذج المذكور. يوضح العمل السابق أن CA-MSCs تكون بشكل عام بنسبة 1:10 للخلايا السرطانية عند قياسها مباشرة من أنسجة المريض. كما هو موضح أدناه ، فإن البدء بنسبة 1: 1 CA-MSC إلى نسبة الخلايا السرطانية ينتج عنه نسبة تقريبية 1:10 من CA-MSC إلى الخلايا السرطانية في كل من المواقع الأولية والنقيلية في نقاط النهاية التجريبية باستخدام هذا النموذج.
  2. جراحة
    ملاحظة: يجب إجراء الجراحة في ظروف معقمة ويجب استخدام أدوات جراحية معقمة. يوصى باستخدام إناث الفئران NSG في عمر 8 أسابيع لهذا النموذج التقويمي.
    1. تخدير الفأر باستخدام الاستنشاق مع الأيزوفلوران (4٪ للحث ، 2٪ للصيانة) والأكسجين (100٪ ، مقياس التدفق 0.5-1 لتر / دقيقة). ضع الماوس على نظام مخروط الأنف قبل الجراحة. لتقديم التخدير طوال الجراحة (انظر التعليمات التفصيلية أدناه) ، أدخل رأس الفأر في نظام مخروط الأنف المبخر الأيزوفلوران.
    2. حقن الفأر تحت الجلد ب 5 ملغم / كجم من الكاربروفين ، وهو مسكن قبل الجراحة ، مع حقنة الأنسولين.
    3. باستخدام المقص ، احلق الجزء الذيلي الأيسر من الفأر بين الهامش الساحلي وعظم الفخذ. تعقيم المنطقة المحلوقة بمحلول بوفيدون اليود ومسحات الكحول. بعد ذلك ، انقل الفأر إلى نظام مخروط الأنف الجراحي واضبط الأيزوفلوران على 1.5٪ للتخدير المداومة.
    4. قم بعمل شق جلدي أفقي بطول 1-2 سم حوالي 2-3 سم تحت الهامش الساحلي. أمسك الصفاق الجداري بالملقط ورفع (سيظهر الصفاق لامعا ويتميز برواسب من الأنسجة الدهنية). قم بعمل شق 1 سم في الصفاق الجداري لفتح تجويف البطن.
    5. لاحظ تجمع الأنسجة الدهنية المحيطة بمبيض الفأر (الجراب المبيضي) عند دخول الصفاق. استخدم ملقطا منحنيا لقبض الجراب المبيضي وفضحه. أثناء الإمساك بقوة بالملقط ، قم بحقن 20 ميكرولتر من معلق الخلية المحضر في الخطوة 3.1.2 في الجراب.
    6. أعد المبيض بعناية إلى تجويف البطن. باستخدام خياطة حمض البولي جليكوليك القابلة للامتصاص 6-0 متصلة بإبرة ، أعد تقريب حواف الشق البريتوني الجداري أغلق شق الجلد بمشابك الجرح.
    7. أخرج الفأر من مخروط الأنف وضع الفأر في قفص نظيف منفصل تحت ضوء دافئ حتى يكتسب وعيه ويحافظ على الاستلقاء القصي. ثم أعد الماوس إلى قفصه.
    8. راقب الفئران يوميا لمدة 3-7 أيام بعد الجراحة. ضع كوبا من جل الكاربروفين في أقفاص الفأر للسيطرة على الألم. قم بإزالة مشابك الجرح بعد 7-10 أيام من الجراحة.

4. مراقبة نمو الورم ووزن جسم الفأر أسبوعيا

  1. نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS): بدءا من الأسبوع الأول بعد التلقيح التقويمي ، قم بإجراء التصوير في الجسم الحي كل أسبوع لمدة 3-4 أسابيع قادمة.
    1. تحضير محلول D-luciferin (ركيزة لوسيفيراز اليراع) عن طريق إذابة 15 مجم في 1 مل PBS والترشيح من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
    2. قم بتشغيل IVIS باتباع تعليمات الشركة المصنعة. انقر فوق أيقونة سطح المكتب برنامج الصور الحية . ثم في لوحة تحكم اكتساب IVIS، حدد تهيئة. يمكن أن تستغرق هذه الخطوة ما يصل إلى 10-15 دقيقة. خلال هذا الوقت ، قم بإعداد الفئران للتصوير.
    3. قم بتخدير كل فأر باستخدام غرفة الأيزوفلوران المتصلة ب IVIS (2٪ -4٪ إيزوفلوران ومقياس تدفق الأكسجين إلى 0.5-1 لتر / دقيقة). حقن D-luciferin (100 ميكرولتر / 10 جم من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام حقنة الأنسولين.
    4. ضع المحقون باللوسيفيرين مرة أخرى في حجرة الأيزوفلوران.
      ملاحظة: من المهم تسجيل وقت الحقن من أجل الحفاظ على اتساق الوقت بين حقن اللوسيفيرين وأداء التصوير طوال الدراسة.
    5. انقل الفأر المخدر إلى غرفة التصوير واضبط نظام التصوير على الإعدادات المناسبة. ثم احصل على الصورة في الوقت المناسب.
    6. بعد حفظ الصور ، قم بإزالة الفئران من غرفة التصوير وضعها مرة أخرى في أقفاص كل منها.
      ملاحظة: يمكن أيضا تسمية CA-MSCs بعلامة الفلورسنت والهجرة / ورم خبيث مشترك لخلايا CA-MSCs و OVCAR3-Luc التي تتم مراقبتها في الجسم الحي باستخدام قناة فلورية على IVIS.

5. تقييم CA-MSC: الرواسب النقيلية للخلايا السرطانية

  1. عند الوصول إلى نقطة النهاية المحددة مسبقا (زيادة الوزن >20٪ مع وجود الاستسقاء ، وفقدان الوزن <10٪ ، وتقرح الورم ، ودرجة تكييف الجسم 2 أو أقل17) ، قم بالقتل الرحيم للفئران وفقا لمعايير رعاية المؤسسية.
  2. قم بإجراء تشريح على كل فأرة على حدة. ضع إبرة معقمة 18 جم داخل الصفاق لشفط أي استسقاء. بعد ذلك ، قم بفضح تجويف الصدر والبطن. تحديد المرض النقيلي الإجمالي عن طريق الفحص البصري لإصابة الورم في أعضاءالفئران 18.
  3. قم بإزالة أنسجة الورم باستخدام مشرط معقم وإما أنا) الإصلاح في بارافورمالدهيد لتضمين البارافين في نهاية المطاف ، ب) تجميد فلاش وتضمينه في وسائط تضمين ناظم التبريد بدون وصفة طبية ، ج) تجميد فلاش لتحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين في اتجاه مجرى النهر ، أو رابعا) الانفصال في خلايا مفردة لقياس التدفق الخلوي أو عزل FACS.
    ملاحظة: تظل CA-MSCs قابلة للتطبيق في هذا النموذج ويمكن إعادة عزلها للتطبيقات النهائية. اعتمادا على الهدف من الدراسة ، يمكن التحقيق في تفاعلات CA-MSC للخلايا السرطانية من خلال الأساليب الكيميائية المناعية ، أو مناهج قياس التدفق الخلوي ، أو الحفاظ على الخلايا المعاد عزلها في الثقافة.

النتائج

يحاكي النهج الموصوف عن كثب البيئة المكروية الداعمة لسرطان المبيض (على وجه الخصوص ، السرطان المصلي عالي الدرجة) عن طريق الحقن المشترك للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من المريض (CA-MSCs) وخلايا سرطان المبيض في الجراب المبيضي. أولا ، تم عزل CA-MSCs من سرطان المبيض المصلي البشري ال...

Discussion

على الرغم من الجهود السريرية والبحثية الكبيرة ، فقد تم إحراز تقدم ضئيل في علاج سرطان المبيض والوقايةمنه 1. بينما تم استخدام مجموعة متنوعة من نماذج الفئران لدراسة تطور سرطان المبيض والنقائل ، فقد واجهت هذه النماذج قيودا كبيرة. على وجه الخصوص ، لم تتمكن نماذج ?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

Acknowledgements

نود أن نشكر برنامج العينات الحيوية للأورام النسائية - Promark للمساعدة في جمع الأنسجة. يتم دعم LGC من قبل Tina's Wish Rising Star Grant و The Mary Kay Foundation.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% trypsin/0.02% EDTASigmaSLCD2568
Anti-human CD105BD Pharmingen560847
Anti-human CD73BD Pharmingen555596
Anti-human CD90BD Pharmingen561443
B27Gibco17504-044
β-FGFGibcoPHG0261
β-mercaptoethanolMP Biomedicals194834
CarprofenHenry Schein11695-6934-1
D-luciferinPerkinElmer122799
DMEDGibco11995-065
EGFGibcoPHG0311
GentamicinGibco15710072
Heat-inactivated FBSGibco16000069
InsulinGibco12585014
Insulin syringeBD Pharmingen324704
In vivo imaging system IVISPerkinElmerIVIS Lumina X5
MatrigelCorning354230
MEBM (mammary epithelial cell basal medium)ATCCPCS-600-030
Mycoplasma test kitABmG238
NSG miceThe Jackson Laboratory5557
OVCAR3ATCCHTB-161
Penicillin/streptomycinGibco15070063
Polyglycolic Acid sutureACE003-2480

References

  1. American Cancer Society. K. S. f. O. C. American Cancer Society. , (2020).
  2. Konecny, G. E., et al. Prognostic and therapeutic relevance of molecular subtypes in high-grade serous ovarian cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (10), (2014).
  3. Verhaak, R. G., et al. Prognostically relevant gene signatures of high-grade serous ovarian carcinoma. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 517-525 (2013).
  4. Tothill, R. W., et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 14 (16), 5198-5208 (2008).
  5. Ghoneum, A., Afify, H., Salih, Z., Kelly, M., Said, N. Role of tumor microenvironment in ovarian cancer pathobiology. Oncotarget. 9 (32), 22832-22849 (2018).
  6. Coffman, L. G., et al. Human carcinoma-associated mesenchymal stem cells promote ovarian cancer chemotherapy resistance via a BMP4/HH signaling loop. Oncotarget. 7 (6), 6916-6932 (2016).
  7. Coffman, L. G., et al. Ovarian carcinoma-associated mesenchymal stem cells arise from tissue-specific normal stroma. Stem Cells. 37 (2), 257-269 (2019).
  8. Spaeth, E. L., et al. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS One. 4 (4), 4992 (2009).
  9. Atiya, H., Frisbie, L., Pressimone, C., Coffman, L. Mesenchymal stem cells in the tumor microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 31-42 (2020).
  10. Magnotti, E., Marasco, W. A. The latest animal models of ovarian cancer for novel drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (3), 249-257 (2018).
  11. Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and transgenic mouse models of epithelial ovarian cancer and non-invasive imaging modalities to monitor ovarian tumor growth in situ: applications in evaluating novel therapeutic agents. Current Protocols in Pharmacology. 45 (1), 1-26 (2009).
  12. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. The Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
  13. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma-associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. The Journal of Clinical Investigation. 121 (8), 3206-3219 (2011).
  14. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (2), 79-85 (2002).
  15. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
  16. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  17. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  18. Fan, H., et al. Epigenomic reprogramming toward mesenchymal-epithelial transition in ovarian-cancer-associated mesenchymal stem cells drives metastasis. Cell Reports. 33 (10), 108473 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CA MSCs NSG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved