تعزيز محتوى الورم من خلال التشريح الكلي للورم

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لزيادة نسبة محتوى الورم في عينات الأنسجة المدمجة في البارافين الثابت بالفورمالين.

Abstract

إن وجود أنسجة ملوثة غير ورمية في الأنسجة المدمجة في البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE) يمكن أن يقوض بشكل كبير الدراسات الجينومية. في ما يلي نصف التشريح الكبير، وهي طريقة مصممة لزيادة النسبة المئوية لمحتوى الورم في عينة الأنسجة عن طريق إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها والقضاء عليها قبل إجراء عمليات استخراج الحمض النووي في المصب. تم تقسيم كتل الأنسجة FFPE لإنتاج 4-5 ميكرومتر من أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح. تم تقديم قسم تمثيلي لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وتمت مراجعته لاحقا من قبل أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة. خلال المراجعة ، حدد أخصائي علم الأمراض وميز مناطق أنسجة الورم في H & E. بمجرد الانتهاء ، تم استخدام H & E المحدد لتوجيه استئصال الأقسام التسلسلية غير الملطخة من نفس كتلة الأنسجة. لإثبات آثار التشريح الكلي، تم تشغيل الحمض النووي الريبي المستخرج من الأورام اللمفاوية الكبيرة المنتشرة ذات الخلايا البائية الكبيرة المنتشرة (DLBCL) على فحص تعبير جيني رقمي قادر على تحديد النوع الفرعي DLBCL وحالة نقل BCL2. أظهرت النتائج أن التشريح الكلي غير النوع الفرعي أو مكالمات حالة نقل BCL2 في 60٪ من العينات التي تم فحصها. في الختام ، يعد التشريح الكلي طريقة بسيطة وفعالة لإجراء إثراء الورم قبل استخراج الحمض النووي ، والذي يمكن بعد ذلك استخدام منتجه بثقة في الدراسات الجينومية النهائية.

Introduction

تمثل الأنسجة المدمجة في البارافين (FFPE) الثابتة بالفورمالين ، والتي تم جمعها كجزء من عملية التشخيص السريري الطبيعية والاحتفاظ بها في مستودعات الأنسجة السريرية ، موردا هائلا للبحوث البشرية ، بما في ذلك أبحاث السرطان¹. مع تعمق فهمنا للأمراض البشرية ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الأمراض ، التي كان يعتقد سابقا أنها كيانات فردية تستند إلى الخصائص المورفولوجية والمناعية ، تتكون في الواقع من أنواع فرعية جزيئية متميزة تتطلب اختبارات النمط الفرعي الجزيئي. ونتيجة لذلك، أصبحت المقايسات الجينومية عالية الحساسية القادرة على تمييز هذه الأنواع الفرعية ذات أهمية متزايدة². على الرغم من أن أنسجة FFPE تشتهر بأنها غير متوافقة بشكل جيد مع التقنيات الجينومية بسبب المشكلات المتعلقة بالتثبيت ، مع تطور التكنولوجيا والبروتوكولات ، إلا أن هذه التقنيات أصبحت متوافقة بشكل متزايد مع تنسيق الأنسجة المنتشر سريريا^في كل مكان ^3,4,5. ومع ذلك ، غالبا ما تكون أنسجة FFPE عبارة عن خليط من مواد الأنسجة السرطانية وغير السرطانية ، حيث يكون وجود مواد غير ورمية غير مرغوب فيه في كثير من الأحيان ويمكن ، إذا كان موجودا بنسبة عالية ، أن يقوض ويؤثر بشكل كبير على نتائج التحليلات الجينومية⁶. في الواقع ، يتم استخدام الحد الأدنى من محتوى الورم بنسبة 60٪ في مثل هذه التحليلات ، حيث يمكن استبعاد الأنسجة التي لا تصل إلى هذه العتبة ، على الرغم من استيفاء معايير الدراسة⁷. يمكن أن يكون هذا مشكلة خاصة في حالات الأمراض النادرة ، حيث تكون أنسجة المرضى ثمينة ويصعب جمعها بأعداد كبيرة.

التشريح الكلي هو طريقة تقلل من آثار انخفاض محتوى الورم عن طريق تقليل كمية الأنسجة الطبيعية³. يمكن أن تؤدي إزالة هذه المواد المربكة غير السرطانية قبل استخراج الحمض النووي إلى زيادة كبيرة في محتوى النسبة المئوية للورم وبالتالي نقاء الورم للأحماض النووية المستخرجة. يعتمد استئصال الأنسجة بشكل حاسم على المراجعة المرضية للخبراء ، حيث يتم تحديد منطقة الورم ووضعها في دائرة على قسم الأنسجة الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) الذي تم إنشاؤه حديثا من قبل أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة⁸. ثم يتم استخدام H & E الدائري لتوجيه إزالة وجمع الأنسجة غير المرغوب فيها والمستهدفة ، على التوالي. يصف هذا البروتوكول خطوات التشريح الكلي من المراجعة المرضية من خلال حصاد الأنسجة كما تم إجراؤه في المختبر الأساسي التقني لموارد عينات الإيدز والسرطان (ACSR) في Mayo Clinic.

Protocol

تم جمع جميع العينات واستخدامها وفقا لبروتوكولات IRB المعتمدة في Mayo Clinic (PR16-000507 وPR2207-02).

1. إعداد العينات

1. قم بتشغيل حمام الماء العائم للأنسجة. اضبط درجة الحرارة على 39 درجة مئوية واسمح للماء بالوصول إلى درجة الحرارة. نقع عصي جمع خشبية في الحمام المائي.
2. تحديد واسترداد كتل الأنسجة FFPE ليتم تقسيمها.
3. شرائح المجهر قبل التسمية باستخدام علامة دائمة من الدرجة النسيجية يمكنها تحمل غسل المذيبات.
4. استخدم ميكروتوم لتقسيم كتل FFPE. قطع ما لا يقل عن 2 أقسام كاملة الوجه بسماكة 4-5 ميكرومتر لكل قسم لكل كتلة (الشكل 1A).
5. انقل الشريط المقطوع حديثا لأقسام الأنسجة إلى حمام تعويم الأنسجة الذي تم تسخينه مسبقا لتركيب الشرائح (الشكل 1B ، C).
   ملاحظة: يساعد الماء الدافئ على "كي" التجاعيد في الأقسام (الشكل 1C).
6. عند التعامل مع كل مقطع بالتتابع، استخدم الملقط لكسر مقطع واحد بعيدا عن الشريط (الشكل 1D).
7. اجمع القسم الفردي على شريحة مجهر مصنفة مسبقا.
   1. اغمر شريحة المجهر بزاوية أسفل القسم، مع وضع الشريحة بحيث تلامس حافة قسم الأنسجة الشريحة (الشكل 1E).
   2. بمجرد ملامسة قسم الأنسجة ، اسحب الشريحة من حمام التعويم ببطء للسماح لقسم الأنسجة بتصويب التدفق ضد الشريحة عند خروجها من الماء (الشكل 1F).
8. قم بتركيب 1 قسم أنسجة لكل شريحة وكرر حتى يتم جمع جميع الأقسام.
9. اترك أقسام الأنسجة المثبتة على الشريحة تجف جيدا في درجة حرارة الغرفة (RT).

2. المراجعة المرضية

1. قم بإجراء تلطيخ H&E على قسم أنسجة تمثيلي واحد لكل كتلة⁹.
2. أرسل H&Es الملطخة حديثا للمراجعة المرضية من قبل أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة.
   ملاحظة: أثناء المراجعة ، يحدد أخصائي علم الأمراض ويسجل النسبة المئوية لمحتوى الورم في كل نسيج ويدور حول منطقة الورم على كل شريحة H & E (انظر الشكل 2 والشكل 3 ، الصف 1). يوضح الجدول 1 النسبة المئوية لمحتوى الورم حسب الخلوية المحددة أثناء المراجعة المرضية ل H&Es للعينات من A إلى E الموضحة في الشكل 3 ، الصف 1. تتطلب الأقسام التي تحتوي على <60٪ من محتوى الورم تشريحا كليا⁷. يعتمد عدد الأقسام اللازمة لاستخراج الحمض النووي على حجم منطقة الورم المحاط بالدائرة. وإذا اقتطعت أقسام غير كافية في القسم 1 من البروتوكول وكان من الممكن إجراء مزيد من الاقتطاعات، فقد يلزم عندئذ خفض أقسام إضافية.

3. إزالة البارافينات

1. في غطاء الدخان ، املأ مسبقا طبقين من أطباق تلطيخ الزجاج بمادة الأنسجة غير المخففة D-Limonene أو مذيب قائم على d-Limonene وطبق تلطيخ زجاجي 1 بالإيثانول الجزيئي غير المخفف 200-proof.
   تحذير: تجنب ملامسة د-ليمونين للجلد والعينين، وتجنب استنشاق البخار أو الضباب، وابتعد عن مصادر الاشتعال. حافظ على الإيثانول بعيدا عن الحرارة والشرر واللهب المكشوف ، وتجنب الانسكاب والتلامس مع الجلد أو العينين ، وتهوية جيدة وتجنب أبخرة التنفس.
   ملاحظة: املأ الأطباق بما يكفي لغمر الشرائح المثبتة على الأرفف (الشكل 4A) ؛ مطلوب 250 مل لملء أطباق تلطيخ 20 شريحة المعروضة. استبدل غسل d-Limonene والإيثانول بعد كل 40 منزلقة. D-Limonene (C 10 H₁₆) هو بديل ، فعال بالمثل ، وعامل إزالة الشمع أقل سمية للزيلين الذي أصبح أكثر شيوعا في المنهجيات النسيجية وينتج عنه نوعية جيدة من الحمض النووي بعد استخراج₁₀،¹¹،¹²،^13،14. على الرغم من أنه يمكن تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام بدائل أكثر ملاءمة للبيولوجيا¹⁵ ، إلا أن آثارها ، إن وجدت ، على جودة الحمض النووي المستخرج لا تزال بحاجة إلى تحديد.
2. قم بتركيب الشرائح المثبتة على أنسجة FFPE غير الملطخة في رفوف شرائح Coplin الزجاجية (الشكل 4A ، داخلي).
3. غمر الشرائح المثبتة في غسل d-Limonene 1 لمدة 2 دقيقة ؛ حراج بلطف لأول 20 ثانية.
   ملاحظة: لتقليل الترحيل بين الغسيلات، عند إزالة رف الشرائح من الغسيل، اسمح للحامل بالتصريف لفترة وجيزة قبل وضع الجزء السفلي من الحامل برفق على المناديل الورقية لإزالة الغسيل الزائد.
4. غمر الشرائح المثبتة في غسل D-Limonene غير المخفف 2 لمدة 2 دقيقة ؛ حراج بلطف لأول 20 ثانية. قم بإزالة الرف وتصريفه وربته مرة أخرى.
5. غمر الشرائح المثبتة في غسل الإيثانول لمدة 2 دقيقة ؛ حراج بلطف لأول 20 ثانية. قم بإزالة الرف وضعه على نسيج ماص لتصريفه. اترك الشرائح لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق على الأقل ، ولكن ليس أكثر من 2 ساعة.

3. التشريح الكلي

1. على مقاعد البدلاء ، املأ وعاء زجاجي كوبلن مسبقا ب 50 مل من الجلسرين بنسبة 3٪ في الماء الخالي من DNase / RNase
   ملاحظة: استبدل غسل الجلسرين بعد كل 40 منزلقة.
2. التسمية المسبقة والتعبئة المسبقة 1.5 مل microtubes مع 160 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم الأنسجة لكل microtube.
   ملاحظة: استخدمت عمليات استخراج الأحماض النووية التي أجريت بعد التشريح الكلي مجموعة استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي FFPE (جدول المواد). وبالتالي ، فإن المخزن المؤقت لهضم الأنسجة المستخدم في هذا البروتوكول يتكون من 10 ميكرولتر من Proteinase K و 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت PKD.
3. تتبع العلامات المرضية على H & E على الجزء الخلفي من شرائح الأنسجة deparaffinized.
   ملاحظة: بالمقارنة مع الأنسجة غير المنزوعة البارافين (الشكل 3 ، الصف 2 والشكل 4 ب) ، تكون الأنسجة المنزوعة البارافين بيضاء ومرئية للغاية (الشكل 3 والصف 3 والشكل 4 ج). هذه الرؤية المتزايدة وإمكانية التمييز لميزات الأنسجة المنزوعة البارافينات هي التي تسمح بالتشريح الكلي. ضع H & E وجها لأسفل على المقعد وضع الجزء الأمامي من الشريحة المنزوعة البارافينية على الجزء الخلفي من أخصائي علم الأمراض المطابق الذي تمت مراجعته H & E (الشكل 4D). قم بمحاذاة الأنسجة المنزوعة البارافين مع أنسجة H&E (الشكل 4E). يعد تتبع علامات أخصائي علم الأمراض خطوة حاسمة في عملية التشريح الكلي ، ويجب توخي الحذر لإعادة إنتاج هذه العلامات بأكبر قدر ممكن من الدقة. يمكن أن يكون هذا تحديا خاصا للأنسجة الصغيرة أو المنفصلة مثل العينات B و D و E (الشكل 3 والشكل 4E والشكل 4E المضمن i). للمساعدة في التتبع ، يجب على المرء استخدام علامة دقيقة حبرية أو علامة متناهية الصغر (الشكل 4E ، الجزء الثاني الداخلي) لتتبع العلامات التي رسمها أخصائي علم الأمراض. قد تكون مناديل الإيثانول مفيدة لإزالة الأخطاء والسماح بالتتبع إذا لزم الأمر.
4. أدر الأنسجة الانزلاقية المنزوعة البارافينية المحددة الآن وجها لوجه وتتبع خط العلامة بزاوية شفرة حلاقة نظيفة لقطع حواف منطقة الورم مسبقا.
5. التعامل مع كل شريحة بالتتابع ، اغمس الشرائح المنزوعة البارافين في محلول الجلسرين بنسبة 3٪. تأكد من غمر الأنسجة بالكامل قبل إزالة الشريحة ببطء (الشكل 4F).
   ملاحظة: الغرض من انخفاض الجلسرين هو تثبيط الأنسجة للمساعدة في جمع الأنسجة ولكن أيضا للحد من تراكم الشحنة الساكنة التي يمكن أن تسبب تنافرا بين الأنسجة والأنبوب الدقيق البلاستيكي الذي يجب وضع الأنسجة التي تم جمعها فيه.
6. امسح الجزء الخلفي من الشريحة برفق بمنديل لإزالة محلول الجلسرين الزائد ، وضع الشريحة على المقعد ، ومسح الوجه الجانبي لأسفل. اترك الأنسجة لتجف لفترة وجيزة لمدة 1-2 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن أن يؤثر ترحيل الجلسرين الزائد في عملية الاستخراج سلبا على إنتاجية وجودة عمليات استخراج الأحماض النووية. يجب أن تكون الأنسجة رطبة قليلا ولكنها ليست رطبة بشكل واضح عند جمعها.
7. اعتمادا على المكان الذي تقع فيه منطقة اهتمام الورم على الشريحة، استخدم الحافة المسطحة لشفرة الحلاقة إما (أ) لجمع أنسجة الورم مباشرة، باستخدام الحلاقة لكشط / جمع الأنسجة ذات الأهمية من الشريحة، أو (ب) إزالة الأنسجة غير السرطانية والتخلص منها أولا قبل جمع أنسجة الورم ذات الأهمية (الشكل 3).
   ملاحظة: تميل الأنسجة المجمعة إلى التجمع أو اللف في أسفل الشفرة (الشكل 4G)
8. استخدم عصا خشبية لإزالة الأنسجة المجمعة من الشفرة (الشكل 4H والجزء الداخلي) ونقلها إلى الأنبوب الدقيق المناسب المسمى مسبقا والمملوء مسبقا (الشكل 4I).
   ملاحظة: يعمل المخزن المؤقت للهضم على "سحب" الأنسجة من الالتقاط الخشبي إلى السائل.
9. انتقل إلى استخراج الحمض النووي.
   ملاحظة: تم الانتهاء من استخراج الأحماض النووية باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي FFPE وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وتم تحديد كمية الأحماض النووية الناتجة باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية. تم تشغيل الحمض النووي الريبي الناتج على اختبار DLBCL90 القائم على التنميط الرقمي للتعبير الجيني¹⁶.

النتائج

تم تقسيم ما مجموعه 5 كتل أنسجة FFPE كبيرة الانتشار من سرطان الغدد الليمفاوية كبيرة الخلايا البائية (DLBCL) ، وكانت الأقسام الناتجة إما تشريح كبير أو لم يتم تشريحها قبل استخراج الحمض النووي. تم تشغيل الحمض النووي الريبي المستخرج على فحص DLBCL90¹⁶. تم تشغيل عينات التشريح الكلي مرتين ، مرة واحدة باستخدام 5 ميكرولتر من تركيز مخزون الحمض النووي الريبي ولكن ليس أكثر من 300 نانوغرام من إجمالي مدخلات الحمض النووي الريبي ومرة واحدة باستخدام 5 ميكرولتر من مخزون الحمض النووي الريبي المخفف لمطابقة مدخلات الحمض النووي الريبي لنظرائهم غير التشريحيين. وترد نتائج DLBCL90 في الجدول 2.

يتكون DLBCL من 3 أنواع فرعية متميزة من خلايا المنشأ (COO) ذات استجابة علاجية مختلفة ، وهي GCB و ABC ومجموعة وسيطة تعرف باسم UNC^17,18 غير المصنفة أو ^UNC. وكثيرا ما تلاحظ أيضا عمليات النقل التي تنطوي على MYC و BCL2 و أو BCL6 بمفردها أو مجتمعة (ضربة مزدوجة أو ثلاثية) في DLBCL ، وخاصة في النوع الفرعي^{GCB 19}. يعد فحص DLBCL90 توسعا لسابقه ، الفحص السريري Lymph2Cx ، وبالتالي فهو قادر على تحديد النوع الفرعي DLBCL COO ولكن تم تطويره بشكل أساسي لتحديد العينات التي تحتوي على عمليات نقل مزدوجة الضرب (DH) تتضمن BCL2 باستخدام التعبير الجيني الرقمي كبديل للتهجين الفلوري في الموقع (FISH) ^16,20. تظهر النتائج الواردة في الجدول 2 أن التشريح الكلي غير إما COO أو حالة DHITsig تستدعي 60٪ (3/5) من العينات التي تم فحصها.

لم يكن للتشريح الكلي للعينة A أي تأثير على استدعاء COO ولكنه غير استدعاء DHITsig من NEG إلى UNCLASS ، وقد لوحظ هذا التغيير بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينة المجهرية ومع درجات احتمال مماثلة (0.224 ، 0.254). وعلى النقيض من ذلك، لم يكن للتشريح الكلي للعينة C أي تأثير على استدعاء DHITsig ولكنه غير استدعاء مدير العمليات من GCB إلى UNC. مرة أخرى ، لوحظ هذا التغيير بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينة المجهرية المجهرة. ومع ذلك ، عند 0.117 ، كان احتمال استدعاء COO أقرب إلى عتبة المكالمة البالغة 0.1 للعينة المجهرية مع انخفاض مدخلات الحمض النووي الريبي. على غرار العينة A ، لم يكن للتشريح الكلي للعينة E أي تأثير على استدعاء COO ولكنه غير استدعاء DHITsig. ومع ذلك ، بالنسبة للعينة E ، تغيرت المكالمة من UNCLASS إلى NEG وفعلت ذلك بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينة المجهرية مع استدعاءات احتمالية مماثلة بشكل معقول (0.849 ، 0.833). ومن الجدير بالذكر أن تغيير النداء هذا إلى DHITsig NEG منطقي بيولوجيا بالنظر إلى أن العينة E وجدت إلى ABC-DLBCL ، وتم الإبلاغ عن عمليات نقل مزدوجة الضرب تنطوي على BCL2 لوحظت حصريا في GCB-DLBCL¹⁹.

الشكل 1: إنشاء مقاطع أنسجة مثبتة على الشرائح باستخدام ميكروتوم. (أ) كتلة أنسجة FFPE مثبتة في مكانها بواسطة تشاك microtome ومقطوعة لإنتاج شريط من مقاطع أنسجة FFPE المتتابعة. (ب) باستخدام عصي خشبية منقوعة مسبقا ، يتم جمع الشريط من الميكروتوم ونقله إلى حمام مائي دافئ. (ج) يساعد دفء الماء على تسوية التجاعيد في شريط الأنسجة. (د) تتم إزالة مقاطع أنسجة FFPE الفردية من شريط الأنسجة عن طريق وضع ملقط مغلق عند تقاطع قسمين وفتح الملقط بلطف ، مما يؤدي إلى فصل الأقسام عن بعضها البعض. (ه) تجمع المقاطع من الماء عن طريق غمر شريحة زجاجية بزاوية وتحريك الجانب برفق نحو قسم الأنسجة حتى تلامس حافة القسم الشريحة الزجاجية. (F) بمجرد لمس الشريحة والقسم ، قم بإزالة الشريحة ببطء من الماء ، مما يسمح لقسم الأنسجة بالسقوط على الشريحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: علم الأمراض والمراجعة النسيجية لأقسام ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E). (A ، B) يخضع قسم أنسجة H & E لمراجعة مجهرية من قبل أخصائي أمراض معتمد من مجلس الإدارة. (ج، د) بمجرد أن ينظر أخصائي علم الأمراض إلى الأنسجة بأكملها ويجد أنها ليست أنسجة ورم بنسبة 100٪ ، سيستخدم أخصائي علم الأمراض علامة لتطويق منطقة الورم في الأنسجة. (E,F) يظهر حمل H&E المميز مقابل كتلة أنسجة FFPE الأصلية أنه ليس كل الأنسجة مادة ورمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: عينات الأنسجة. توضح هذه الصورة المقاطع التي تمت مراجعتها بشكل مرضي والورم الذي يحمل علامة H&Es (الصف 1) ، وأقسام أنسجة FFPE غير المعالجة المثبتة على الشرائح (الصف 2) ، وأقسام أنسجة FFPE المثبتة على الشريحة (الصف 3) ، وأقسام أنسجة FFPE المثبتة على الشريحة مع علامات علم الأمراض التي تم تتبعها على الجزء الخلفي من الشريحة (الصف 4) ، وأقسام أنسجة FFPE المثبتة على الشريحة (الصف 5) (الصف 5) للعينات الخمس (A-E) المستخدمة لإثبات هذا البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: إزالة البارافينات والتشريح الكلي لأقسام أنسجة FFPE: (أ) في غطاء الدخان ، يتم غسل أنسجة FFPE المثبتة في رف منزلق في غسلتين d-limonene وغسل واحد من الإيثانول. (ب، ج) بعد الغسيل ، تمت إزالة جميع البارافين ، ولم يتبق سوى الأنسجة على الشريحة ، والتي أصبحت الآن بيضاء ومرئية للغاية مقارنة بنظيرتها المغسولة مسبقا. (د) يتم وضع قسم الأنسجة المثبتة على الشريحة المنزوعة البارافينية وجها لأسفل على الجزء الخلفي من علامة H&E (E) ثم يتم تتبع علامات منطقة الورم على H & E على الجزء الخلفي من الشريحة المنزوعة البارافينية باستخدام علامة دائمة دقيقة أو متناهية الصغر (F) ثم يتم غمس قسم الأنسجة المثبتة على الشريحة المنزوعة البارافين في غسل الجلسرين لترطيب قسم الأنسجة للجمع. تتم إزالة الشريحة ببطء من الجلسرين ، ويتم مسح الجزء الخلفي من الشريحة بمنديل لإزالة الجلسرين الزائد قبل وضع نسيج الشريحة وجها لوجه على المقعد. (ز) باستخدام الجانب المسطح من شفرة حلاقة نظيفة ، يتم تشريح الأنسجة بشكل كبير ، ويتم التخلص من الأنسجة غير المرغوب فيها خارج علامات أخصائي علم الأمراض قبل جمع الأنسجة ذات الأهمية ، والتي تتجمع على طول حافة الشفرة. (ح) تستخدم عصا خشبية لإزالة الأنسجة المجمعة من حافة الشفرة. (I) ثم يتم نقل الأنسجة إلى مخزن مؤقت لهضم الأنسجة مملوء مسبقا بالأنابيب الدقيقة ويكون جاهزا لاستخراج الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نموذج معرف	الأنسجة الكاملة (أ)		منطقة دائرة من الأنسجة (ب)		المحتوى الكلي للورم في الأنسجة الكاملة (ج)	زيادة أضعاف محتوى الورم عن طريق التشريح الكلي (د)	غير مجهري (ه)		تشريح كبير (و)
	٪ ورم قابل للحياة	٪ أخرى	٪ ورم قابل للحياة	٪ أخرى			# من 5 ميكرومتر الشرائح المستخرجة	الحمض النووي الريبي (نانوغرام / ميكرولتر)	# من 5 ميكرومتر الشرائح المستخرجة	الحمض النووي الريبي conc (نانوغرام/ميكرولتر)
العينة أ	60	40	75	25	45	1.7	2	19.0	4	58.3
النموذج باء	60	40	65	35	39	1.7	1	34.0	2	60.0
العينة جيم	40	60	65	35	26	2.5	1	13.7	2	46.2
العينة د	35	65	90	10	32	2.9	1	57.3	2	60.0
العينة E	20	80	30	70	6	5.0	3	25.2	3	44.6

الجدول 1: بيانات مراجعة علم الأمراض. ويبين الجدول (أ) النسبة المئوية للورم القابل للحياة في قسم الأنسجة بأكمله حسب المنطقة، (ب) النسبة المئوية للورم القابل للحياة في المنطقة المحاط بدائرة / معلم علم الأمراض أثناء الاستعراض حسب الخلوية، (ج) الخلوية الكلية المقدرة للورم للأنسجة بأكملها (أ × ب)، (د) الزيادة المقدرة في الطية في خلية الورم التي تحققت مع التشريح الكلي، (ه وو) عدد 5 ميكرومتر من مقاطع الأنسجة المثبتة على شريحة FFPE غير الملطخة المستخرجة وتركيزات الحمض النووي الريبي الناتجة عن العينات المتطابقة غير المجهرية والتشريح الكلي. ٪ أخرى تشير إلى جميع الأنسجة الأخرى الموجودة في عينة معينة ليست أنسجة الورم ويمكن أن تشمل النسيج الضام والخلايا الليفية اللحمية والأوعية الدموية بالإضافة إلى العناصر اللحمية المتأصلة الأخرى. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

نموذج معرف		إدخال الحمض النووي الريبي (نانوغرام)	DLBCL90 مكالمة COO	احتمال استدعاء DLBCL90	DHITsig دعوة	احتمال DHITsig pos	DHITsig neg probability
لم يتم تشريحها بشكل كبير	العينة أ	95.0	جي سي بي	0.000	NEG	0.135	0.865
	النموذج باء	170.0	جي سي بي	0.000	NEG	0.032	0.968
	العينة جيم	68.5	جي سي بي	0.028	NEG	0.033	0.967
	العينة د	286.5	ايه بي سي	0.998	NEG	0.002	0.998
	العينة E	126.0	ايه بي سي	0.989	أون كلاس	0.212	0.788
تشريح ماكروستيد	عينة A_M	291.7	جي سي بي	0.000	أون كلاس	0.224	0.776
	عينة B_M	300.0	جي سي بي	0.000	NEG	0.016	0.984
	عينة C_M	231.2	أون كلاس	0.210	NEG	0.015	0.985
	عينة D_M	300.0	ايه بي سي	0.999	NEG	0.002	0.998
	عينة E_M	223.2	ايه بي سي	0.987	NEG	0.151	0.849
تشريح كبير والحمض النووي الريبي المخفف	عينة A_M	95.0	جي سي بي	0.000	أون كلاس	0.254	0.746
	عينة B_M	170.0	جي سي بي	0.000	NEG	0.023	0.977
	عينة C_M	68.5	أون كلاس	0.117	NEG	0.027	0.973
	عينة D_M	286.5	ايه بي سي	0.999	NEG	0.002	0.998
	عينة E_M	126.0	ايه بي سي	0.995	NEG	0.167	0.833

الجدول 2: نتائج فحص التعبير الجيني الرقمي DLBCL90. خمس عينات (A-E) إما لم يتم تشريحها بشكل كبير أو تشريحها قبل إجراء استخراج الحمض النووي. تم تشغيل الحمض النووي الريبي الناتج على فحص DLBCL90 ، حيث الحد الأقصى لحجم إدخال الحمض النووي الريبي هو 5 ميكرولتر. تم تشغيل كل عينة تشريح كبير مرتين باستخدام (أ) 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي للمخزون ما لم يكن من الممكن إجراء حصص من 60 نانوغرام / ميكرولتر و (ب) 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي للمخزون المخفف لمطابقة تركيزات / مدخلات نظرائهم غير المشوهين بشكل كبير. تشير اللاحقة _M إلى أن تلك العينة قد تم تشريحها بشكل كبير. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

غالبا ما تكون أنسجة FFPE عبارة عن مخاليط غير متجانسة من أنسجة الورم والأنسجة غير الورمية. أصبحت الاختبارات الجينومية عالية الحساسية منتشرة بشكل متزايد في كل من الإعدادات السريرية والبحثية ولكن يمكن الخلط بينها وبين وجود أنسجة غير ورمية ملوثة. في الواقع ، يوصى في كثير من الأحيان بمحتوى الحد الأدنى من الورم بنسبة 60٪ للدراسات الجينومية. يمكن تحديد النسبة المئوية للورم من خلال منطقة الأنسجة التي تشغلها مادة الورم أو من خلال نسبة الخلايا السرطانية داخل الأنسجة. على الرغم من أن الورم حسب المنطقة هو مقياس شائع الاستخدام لنقاء الورم ، إلا أنه لا يصور دائما وصفا دقيقا للأنسجة. فكر في منسجتين ، كلاهما يحتوي على 1000 خلية ، منها 500 خلية سرطانية. في الأنسجة A ، تكون الخلايا غير السرطانية البالغ عددها 500 خلية لحمية ذات أحجام مماثلة لتلك الموجودة في الخلية السرطانية. في هذا النسيج ، يمكن اعتبار النسبة المئوية للورم 50٪ من خلال كل من الخلوية والمساحة. في الأنسجة B ، 500 خلية غير سرطانية هي خلايا دهنية ذات أحجام تبلغ 4 أضعاف حجم الخلية السرطانية. في هذا النسيج ، لا تزال النسبة المئوية للورم 50٪ حسب الخلوية ولكن 20٪ حسب المنطقة. يتكون النسيج الثالث ، النسيج C ، من 500 خلية سرطانية بالإضافة إلى 400 خلية دهنية و 800 خلية لحمية ذات أحجام 4x و 0.5x من الخلايا السرطانية ، على التوالي. بالنظر إلى أن 100 خلية دهنية تساوي حجم 800 خلية لحمية ، فإن النسبة المئوية لورم الأنسجة C هي 29٪ حسب الخلوية (500/1700) ولكن لا تزال 20٪ حسب المساحة. يتكون النسيج D أيضا من الخلايا السرطانية والدهنية واللحمية بنسب حجم 1x و 4x و 0.1x. ومع ذلك ، فإن عدد الخلايا هو 400 و 10 و 720 ، على التوالي. وبالتالي ، فإن النسبة المئوية لورم الأنسجة D هي 35٪ حسب الخلوية (400/1130) ولكن 78٪ حسب المنطقة. هذه الأمثلة مفرطة في التبسيط ولا تعكس تركيبات الأنسجة في العالم الحقيقي ولكنها تنقل بوضوح أهمية تكوين الأنسجة والفرق بين محتوى الورم حسب المنطقة والخلوية. الأهم من ذلك ، عندما يتعلق الأمر بإثراء محتوى الورم لاستخراج الحمض النووي في مجرى النهر ، فإن خلية الورم هي السمة الأكثر أهمية بسبب الإمكانات المربكة المتزايدة لاستخراج المواد الجينومية من الخلايا غير السرطانية أكثر من الخلايا السرطانية. هذا لا يؤكد فقط على الحاجة إلى تقييم محتوى الورم في الأنسجة من حيث النسبة المئوية للخلايا ولكن أيضا الحاجة إلى استئصال الأنسجة غير المرغوب فيها من أجل تقليل أي آثار سلبية محتملة للأنسجة غير الورمية. هناك العديد من الطرق المتاحة لإثراء الأنسجة ، وأهمها التشريح الكلي والتشريح الدقيق.

التشريح الكلي ، الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول ، سريعة نسبيا وبسيطة ولا تتطلب معدات مكلفة أو متخصصة. على الرغم من أن التشريح الكلي يمكن أن يحسن بشكل كبير محتوى الورم ، فمن المهم أن نفهم أنه لا يزيل تماما المواد غير الورم. الغرض من التشريح الكلي هو إثراء الأنسجة ذات الأهمية بما فيه الكفاية من خلال استبعاد الأنسجة غير المرغوب فيها من أجل تقليل "الضوضاء" الناشئة عن الأنسجة غير المرغوب فيها ، والتي بدورها يمكن أن تعزز إشارة الاهتمام من الأنسجة ذات الاهتمام. وبالتالي ، فإن إثراء الورم بوساطة التشريح الكلي هو وسيلة لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء من أجل اكتشاف العلامات ذات الأهمية بشكل أفضل ، وخاصة العلامات الجزيئية الخاصة بالورم ذات الوفرة المنخفضة أو التعبير الضعيف. ومع ذلك ، فإن التشريح الكلي له قيود بسبب نقص الدقة التي توفرها الأدوات الخشنة مثل شفرات الحلاقة وهو عرضة لمشكلات الدقة الناجمة عن سمك خط علامة أخصائي علم الأمراض ، بالإضافة إلى الأخطاء المحتملة عند تتبع ترسيم حدود H & E الخاصة بأخصائيي علم الأمراض. كما هو موضح أعلاه ، لا يمكن تحقيق نقاء الورم بنسبة 100٪ بسبب وجود عناصر لحمية متأصلة ومسببة للورم (أي النسيج الضام ، والخلايا الليفية اللحمية ، والأوعية الدموية ، والخلايا الليمفاوية التفاعلية الحميدة ، والبلاعم) المضمنة داخل الورم نفسه. والواقع أن العديد من الأورام الخبيثة الغازية أو الارتشاحية المنتشرة تحفز استجابة قوية للحماة اللدائن اللدائنية اللحمية، مما يؤدي إلى مجموعات من الخلايا السرطانية التي تختلط ارتباطا وثيقا بالخلايا الليفية اللحمية وغيرها من أنواع الخلايا غير الورمية؛ حيث الأورام المرتبطة بهذا النمط من التفاعل اللحمي ، مثل أنسجة سرطان البنكرياس²¹ ، قد تستفيد أكثر من التشريح المجهري الموجه رقميا بدلا من التشريح الكلي اليدوي.

يتم إجراء التشريح المجهري اليدوي تحت المجهر للمساعدة في تحديد وتشريح وعزل خلايا أو مجموعات معينة من الأنسجة باستخدام إبرة أو مشرط وله ميزة زيادة الدقة على التشريح الكلي²². ومع ذلك ، فإن التشريح المجهري اليدوي هو عملية شاقة تفتقر إلى الدقة اللازمة للأنسجة المعقدة ذات محتويات الورم المنخفضة أو الميزات المعقدة التي لا تتوافق مع التشريح اليدوي. يمكن تشريح هذه الأنسجة باستخدام طرق آلية عالية الدقة مثل التشريح المجهري لالتقاط الليزر. في الواقع ، ثبت أن التشريح المجهري الموجه رقميا ينتج عنه نسبة مئوية أعلى من محتويات الورم مقارنة بالتشريح الكلي اليدوي في أنسجة سرطان البنكرياس²³. ومع ذلك ، فإن عيوب هذه الأساليب الآلية عالية الدقة ، مثل الحاجة إلى معدات متخصصة ومكلفة وأفراد مدربين تدريبا عاليا ، أعاقت دمجها في سير العمل. وجدت دراسة أجراها دي بروين وآخرون قارنت آثار التشريح الكلي والتشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) على تنميط التعبير الجيني أن عينات LCM لديها إنتاجية RNA إجمالية منخفضة (متوسط 30 نانوغرام) وتتطلب جولتين من تضخيم mRNA من أجل تلبية عتبة مدخلات إعداد مكتبة cDNA²⁴. وجد المؤلفون أن ملامح التعبير الجيني LCM الناتجة تأثرت بجولات تضخيم الحمض النووي الريبوزي المرسال أكثر من تأثرت الملامح المجهرية بالمساهمات اللحمية غير السرطانية وخلصوا إلى أنه يمكن استخدام التشريح الكلي بشكل كاف لتوليد بيانات تعبير جيني موثوقة²⁴.

ميزة كبيرة من التنميط التعبير الجيني الرقمي NanoString ، وخاصة عند العمل مع الحمض النووي الريبي المشتق من FFPE المتدهور للغاية ، هو أنه لا يتطلب عمليات تعتمد على الأنزيم مثل تضخيم الحمض النووي الريبي أو إعداد مكتبات cDNA. ومع ذلك ، عادة ما يتم تحسين الفحوصات للمدخلات بين 50-300 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي^25,26 ، والتي ، بناء على نتائج دي بروين وآخرون ²⁴ ، قد لا تكون متوافقة مع الأنسجة المجهرية دون زيادة مدخلات الأنسجة ؛ طلب غير موات في عصر يتم فيه جمع عينات الأنسجة بشكل متزايد على شكل خزعات صغيرة بدلا من الاستئصال الجراحي. تراوحت مدخلات الحمض النووي الريبي المستخدمة في فحص DLBCL90 من 68.5 إلى 300 نانوغرام لكل من الأنسجة المجهرية وغير التشريحية. أظهرت النتائج أن التشريح الكلي أدى إلى تغييرات في النداء في 60٪ من العينات التي تم فحصها وأن هذه التغييرات لوحظت بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينات المجهرية التشريحية. ومع ذلك ، فإن احتمال COO لإدخال الحمض النووي الريبي المنخفض قد تجاوز عتبة استدعاء احتمال COO GCB / UNC ، حيث تكون العتبات من 0 إلى <0.1 ل GCB ، و 0.1-0.9 ل UNC ، و >0.9 إلى 1.0 لمكالمات ABC²⁰. الأنواع الفرعية الرئيسية ل DLBCL COO هي GCB و ABC ، والتي تشكل 41٪ و 44٪ من جميع حالات DLBCL ، حيث تمثل UNC مجموعة وسيطة من الاثنين و ABC هي الأكثر عدوانية^20,27. وهكذا، في حين أن تغيير استدعاء مدير العمليات عند التشريح الكلي للعينة C لم يتسبب في تغيير صريح في النوع الفرعي ل COO من GCB إلى ABC، فإن التغيير من GCB إلى UNC قد يشير إلى تحول نحو مرض أكثر عدوانية. وعلاوة على ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن النوع الفرعي للأمم المتحدة ليس مجرد نوع فرعي وسيط وأنه قد يمتلك سمات قابلة للاستغلال العلاجي خاصة بنوع فرعي^{محدد 28}. وبالمثل ، لم يتسبب التشريح الكلي للعينتين A و E في تغييرات صريحة في مكالمات DHITsig من DH سلبي إلى DH إيجابي ، أو العكس بالعكس. ومع ذلك، فإن تحركات عينة GCB (العينة A) من NEG إلى UNCLASS وعينة ABC (العينة E) من UNCLASS إلى NEG عند التشريح الكلي مناسبة بيولوجيا حيث تفيد التقارير بأن عمليات النقل المزدوجة التي تنطوي على BCL2 هي ظاهرة GCB حصرا¹⁹. على الرغم من أن عمليات النقل يتم اكتشافها تقليديا وفي كل مكان بواسطة FISH في الإعدادات السريرية ، إلا أن هناك زخما متزايدا لتحديد طريقة بديلة أقل مشاركة وتستغرق وقتا طويلا للكشف عنها. يعد فحص DLBCL90 أداة مهمة تلبي هذه الحاجة ، حيث يتم تعزيز الأساس المنطقي لاستخدامه من خلال اكتشاف أن هذا الفحص قادر على اكتشاف عمليات النقل المشفرة إلى تحقيقات FISH المستخدمة في التشخيص السريري²⁹.

يحدد بروتوكول التشريح الكلي الموصوف أعلاه طريقة بسيطة تمكن الباحثين من زيادة محتوى الورم في عينات الأنسجة التي عادة ما تكون أقل من عتبات معايير إدراج الدراسة الشائعة الاستخدام. إن تضمين التشريح الكلي في سير عمل الدراسة يمكن الباحثين من إنقاذ الأنسجة الكثيفة بالورم بشكل سيئ من استبعاد الدراسة عن طريق زيادة محتوى الورم الخاص بها. وهذا بدوره يسمح بزيادة الثقة في أن الحمض النووي الريبي الناتج والحمض النووي يمثل الورم قيد التحقيق الجينومي. على الرغم من وجود طرق أخرى أكثر دقة لتشريح الأنسجة ، إلا أنه بالنسبة للأورام التي تنمو بطريقة أكثر توسعا أو غير ارتشاحية أو تشبه الورقة أو صلبة ، فمن المحتمل أن يكون التشريح الكلي كافيا. تسلط النتائج المعروضة هنا الضوء على أهمية نقاء الورم في الفحوصات الجينومية والتشريح الكلي كأداة موثوقة لتحقيق ذلك.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200-proof ethanol	Decon	2701
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit	Qiagen	80234	DNA/RNA FFPE extraction kit
Coplin pots	Various	x
DLBCL90 probes	NanoString	various	Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay
d-Limonene	VWR	89376-092
Forceps	Various	x
Glass micrscope slides	FisherBrand	12-550-15
Glycerol	VWR	0854-1L
Master kits	NanoString	various
Microtome	Leica	RM2265
Microtubes	Ambion	AM12400
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation
nCounter	NanoString	x	Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay
Permanent marker	Electrib Microscope Sciences	72109-12
Razor blade dispenser	Electrib Microscope Sciences	71985-10
Razor blades	Electrib Microscope Sciences	71985-23
Tissue digestion buffer	Qiagen	80234
Ultrapure water	VWR	SH30538.02
Waterbath	Triangle Biomedical Sciences	TFB-120
Wooden stick	FisherBrand	22363158