JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

بروتوكول تفكك الخلايا العصبية هذا مخصص للعينات التي تحتوي على كمية منخفضة من المواد الأولية وينتج عنه تعليق أحادي الخلية قابل للتطبيق للغاية للتحليل النهائي ، مع خطوات تثبيت وتلطيخ اختيارية.

Abstract

يعمل بروتوكول التفكك العصبي هذا (وهو تكييف للبروتوكول المصاحب لمجموعة تفكيك دماغية تجارية للبالغين) على تحسين معالجة الأنسجة استعدادا للتحليل التفصيلي في المراحل النهائية مثل قياس التدفق الخلوي أو تسلسل الخلية الواحدة. يمكن إجراء التفكك العصبي عن طريق التفكك الميكانيكي (مثل استخدام المرشحات أو تقنيات التقطيع أو تريتوريون الماصة) أو الهضم الأنزيمي أو مزيج منهما. يمكن للطبيعة الحساسة للخلايا العصبية أن تعقد الجهود المبذولة للحصول على تعليق خلية واحدة حقيقي وقابل للتطبيق للغاية مع الحد الأدنى من الحطام الخلوي المطلوب لتحليل الخلية الواحدة. تظهر البيانات أن هذا المزيج من التفكك الميكانيكي الآلي والهضم الأنزيمي ينتج باستمرار تعليقا أحادي الخلية قابلا للتطبيق (>90٪) ، متغلبا على الصعوبات المذكورة أعلاه. في حين أن بعض الخطوات تتطلب براعة يدوية، فإن هذه الخطوات تقلل من معالجة العينات وفقدان الخلايا المحتمل. تفصل هذه المخطوطة كل خطوة من خطوات العملية لتجهيز مختبرات أخرى لفصل كميات صغيرة من الأنسجة العصبية بنجاح استعدادا للتحليل النهائي.

Introduction

تم وصف الحصين لأول مرة من قبل عالم التشريح البولونزي ، جوليو سيزار أرانزيو ، في 15001. في تسمية هذا الهيكل المكتشف حديثا ، من المحتمل أن يكون أرانزيو مستوحى من تشابهه الغريب مع فرس البحر من جنس Hippocampus1. يشارك الحصين في استجابات الإجهاد ولكنه معروف على نطاق واسع بدوره في التعلم والذاكرة. وبشكل أكثر تحديدا ، فإن الحصين مسؤول عن تشفير واسترجاع الذاكرة التقريرية والمكانية1.

ينقسم الحصين ، أو الحصين المناسب ، إلى CA1 (أمونيات القرنو) ، CA2 ، و CA3 الفرعية1. بالمقارنة مع بقية الجهاز العصبي ، فإن الحصين له العديد من الخصائص المميزة الفريدة ، بما في ذلك اللدونة وإمكانية تكوين الخلايا العصبية المستمرة2. تكوين الخلايا العصبية هو عملية انتشار وتمايز الخلايا الجذعية العصبية ، تليها اندماجها في الشبكة العصبية الموجودة مسبقا. يقتصر تكوين الخلايا العصبية على المنطقة تحت الحبيبية للتلفيف المسنن والمنطقة تحت البطينية للبطينين الجانبيين (والمصابيح الشمية)3. في حين أن تكوين الخلايا العصبية وفير في التكوين الجنيني ، إلا أنها عملية تستمر مدى الحياة 3,4. على هذا النحو ، ستركز هذه المناقشة على تكوين الخلايا العصبية للبالغين في الحصين.

المناطق تحت البطينية وتحت الحبيبية هي منافذ عصبية المنشأ تحتوي على خلايا إسندية ووعائية ، بالإضافة إلى سلالات غير ناضجة وناضجة من الخلايا الجذعية العصبية5. تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة في هذه المنافذ كخلايا مناعية لتنظيم تكوين الخلايا العصبية6. الخلايا السلفية العصبية هي ذرية الخلايا غير الجذعية للخلايا الجذعية العصبية7. توجد ثلاثة أنواع من السلف العصبي في المنطقة تحت البطينية: الخلايا البائية الشبيهة بالدبقية الشعاعية ، والأسلاف المضخمين للعبور من النوع C ، والخلايا العصبية من النوع A 3,8. يمكن للخلايا السلفية العصبية من النوع B التي تنقسم ببطء في المنطقة تحت البطينية أن تتمايز إلى خلايا من النوع C سريعة الانقسام8. في وقت لاحق ، تتمايز خلايا النوع C إلى خلايا من النوع A8. تهاجر هذه الأرومات العصبية عبر تيار هجرة السطح إلى المصباح الشمي قبل أن تتمايز إلى الخلايا العصبية الداخلية أو الخلايا قليلة التغصن9. هذه الخلايا العصبية الداخلية للبصيلات الشمية هي مفتاح الذاكرة الشمية قصيرة المدى ، والتعلم الترابطي ، في حين أن الخلايا الأحادية التغصن الميالينات محاور الجسم الثفني9. تحدث غالبية تكوين الخلايا العصبية لدى البالغين في المنطقة تحت الحبيبية من التلفيف المسنن ، حيث تم العثور على السلف العصبي الشعاعي من النوع 1 وغير الشعاعي من النوع 23. معظم الخلايا السلفية العصبية مقدر لها أن تصبح خلايا عصبية حبيبية مسننة وخلايا نجمية10. متصلة بواسطة تقاطعات الفجوة ، تشكل الخلايا النجمية شبكات لتعديل اللدونة والنشاط المشبكي واستثارة الخلايا العصبية5. باعتبارها الخلية العصبية المثيرة الأولية للتلفيف المسنن ، توفر الخلايا الحبيبية مدخلات من القشرة الداخلية إلى منطقة CA311.

يمكن عزل مجموعات الخلايا الجذعية العصبية باستخدام استراتيجيات العزل المناعية أو المناعية الفلورية12,13. الأنسجة العصبية يصعب فصلها بشكل خاص. غالبا ما تؤدي الجهود المبذولة للقيام بذلك إلى عينات ذات قابلية ضعيفة للخلية و / أو تفشل في إنتاج تعليق الخلية الواحدة الضروري للتحليل النهائي. يمكن إجراء التفكك العصبي عن طريق التفكك الميكانيكي (مثل استخدام المرشحات أو تقنيات التقطيع أو التحلل الماصي) أو الهضم الأنزيمي أو مزيج من التقنيات14,15. في دراسة لتقييم طرق التفكك العصبي ، تمت مقارنة جدوى وجودة التفكك الميكانيكي اليدوي عن طريق التفكك الميكانيكي للماصة مقابل مجموعات من التقطيع والهضم مع الإنزيمات المختلفة15. تم تصنيف الجودة بناء على كمية كتل الخلايا والحمض النووي أو الحطام دون الخلوي في التعليق المعد15. كان لتعليق الأورام الدبقية الخاضعة للتفكك الميكانيكي اليدوي وحده صلاحية خلوية أقل بكثير من العلاجات التي تحتوي على dispase أو مزيج من DNase و collagenase و hyaluronidase15. وأقر فولوفيتز وآخرون بالتباين في الجدوى والجودة بين الأساليب المختلفة وشددوا على أن عدم كفاية التفكك قد يقلل من دقة التحليل النهائي15.

في دراسة منفصلة ، قارن المؤلفون أكثر من 60 طريقة ومجموعات مختلفة من تفكك الخلايا العصبية المستزرعة14. وشملت هذه الطرق ثمانية أشكال مختلفة من التفكك الميكانيكي اليدوي عن طريق التحلل الماصة، ومقارنة الحضانة مع خمسة إنزيمات فردية على ثلاث فترات مختلفة، ومجموعات مختلفة من التفكك الميكانيكي مع الهضم الأنزيمي أو مزيج من اثنين من الإنزيمات14. لم تسفر أي من الطرق الميكانيكية عن تعليق أحادي الخلية14. أربعة من العلاجات بالإنزيم الواحد ، وعشرة من العلاجات الأنزيمية المركبة ، وأربعة من مجموعات التفكك الميكانيكي مع الهضم الأنزيمي أسفرت عن تعليق خلية واحدة14. الهضم الأنزيمي مع التربيل تليها التربسين-EDTA العينات المنفصلة بشكل فعال14. وبالمناسبة، تميل العينات المعالجة بالتريب و/أو التربسين-EDTA إلى تكوين كتل جيلاتينية14. في حين أجريت هذه الدراسة على الخلايا المستزرعة ، إلا أنها تتحدث عن أوجه القصور في تريتور الماصة أو الهضم الأنزيمي وحده.

لا توجد مقارنات جنبا إلى جنب بين التفكك اليدوي والميكانيكي الآلي. ومع ذلك ، أجرت مجموعة واحدة قياس التدفق الخلوي لمقارنة التفكك الميكانيكي اليدوي وشبه الآلي لأدمغة الفئران بأكملها بالتزامن مع مجموعات التفكك الأنزيمي التجاري أو التربسين16. أسفرت المعالجة باستخدام الفاصل بشكل أكثر اتساقا عن خلايا قابلة للحياة16. بعد الانفصال ، قام المؤلفون أيضا بعزل خلايا Prominin-1 ، وخلايا السلائف العصبية ، والخلايا الدبقية الصغيرة16. بالنسبة لاثنين من مجموعات الخلايا المعزولة الثلاث ، كانت نقاء الخلايا المعزولة أعلى قليلا عندما تمت معالجة العينات باستخدام المنفصل ، مقارنة ب16 يدويا. لاحظ ريس وآخرون أن التباين من شخص لآخر في تقنية السحب يعوق تكرار غلة الخلايا القابلة للحياة في تفكك الأنسجة16. خلص المؤلفون إلى أن التفكك الميكانيكي الآلي يوحد معالجة العينات16.

طريقة التفكك الموضحة في هذه المخطوطة هي مزيج من التفكك الميكانيكي الآلي بالكامل والهضم الأنزيمي، باستخدام حلول مصاحبة لمجموعة تجارية لتفكك الدماغ للبالغين17. على عكس البروتوكولات القياسية ، يقلل هذا البروتوكول المحسن من معالجة العينات ، وينتج عنه تعليق أحادي الخلية قابل للتطبيق للغاية ، ويهدف إلى معالجة الحد الأدنى من كميات الأنسجة الأولية.

Protocol

أجريت التجارب وفقا للمعايير الأخلاقية المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في UAMS. تم شراء إناث الفئران من النوع البري C57Bl6 / J البالغة من العمر 6 أشهر واستضافتها في مجموعات (4 فئران لكل قفص) تحت دورة ضوء / ظلام ثابتة مدتها 12 ساعة.

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد حل مخزون البقع الحية / الميتة القابلة للإصلاح. أعد تشكيل بقعة الفلورسنت مع 20 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
  2. لف القارورة بورق القصدير، وقم بتسميتها على أنها "معاد تشكيلها"، وخزنها على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
  3. تحضير محلول ملحي 0.9 ٪ مع الهيبارين. قم بتخفيف محتويات قارورة واحدة من صوديوم الهيبارين (10000 وحدة USP لكل 10 مل) في 1 لتر من الماء المقطر المزدوج (ddH2O).
  4. تحضير ما يكفي لحوالي 45 مل لكل وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  5. جعل 1 ٪ بارافورمالديهايد (PFA).
    1. في غطاء الدخان ، قم بتسخين صفيحة ساخنة إلى 50 درجة مئوية. في الميكروويف، سخني 100 مل من DDH2O في كوب زجاجي إلى حوالي 60 درجة مئوية. أضف قضيب تحريك مغناطيسي وانقله إلى الصفيحة الساخنة.
    2. في غطاء الدخان ، قم بوزن 1 غرام من PFA وأضف إلى كوب ddH2O. أضف 0.1125 جم من بلورات NaOH واخلطها حتى تذوب (5-10 دقائق).
    3. أضف 0.4 جم من NaPO 4- monobasic واخلطه حتى يذوب (2-5 دقائق). قم بتصفية المحلول بالمكنسة الكهربائية واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl و NaOH.
    4. تبرد على الثلج أو على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة قبل التخزين.
      ملاحظة: يمكن تخزين Aliquots من 1.5 مل في -20 درجة مئوية لمدة عام واحد. تجنب دورات التجميد والذوبان. إذا أصبح المحلول غائما بعد ذوبان الجليد أو تشكل راسب ، فلا ينبغي استخدام المحلول.
      تنبيه: سامة، قابلة للاشتعال. اعمل دائما مع PFA تحت غطاء رأس جيد التهوية ويرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  6. أعد تعليق الإنزيم A المجفف بالتجميد مع 1 مل من المخزن المؤقت A. لا دوامة الحل.
    ملاحظة: إنزيم A و Buffer A بالإضافة إلى المخازن المؤقتة A و Y و Z هي كواشف في مجموعة تفكك الدماغ للبالغين التجارية17.
  7. قسم إنزيم P إلى أليكوتس من 50 ميكرولتر وأعد تعليق الإنزيم A إلى 10 ميكرولتر أليكوتس. وفقا لتعليمات المجموعة ، قم بتخزينها على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. تجنب دورات التجميد والذوبان.

2. يوم التجربة

  1. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي على الطاولة إلى 4 درجات مئوية.
  2. ضع أليكوت (عليات) PFA في الثلاجة للذوبان التدريجي.
  3. ضع البقعة الحية / الميتة المعاد تشكيلها في الظلام (على سبيل المثال ، درج) لتذوب في درجة حرارة الغرفة.
  4. تحضير الألبومين مصل البقر (BSA) المخزن المؤقت. أضف 0.5 جم من BSA إلى 100 مل من محلول 1x Dulbecco المخزن بالفوسفات بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (D-PBS) ، الرقم الهيدروجيني 7.2.
  5. يضاف شريط التحريك ويخلط على طبق التحريك لمدة 30 دقيقة. انقل إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل وخزنها عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: استخدم دائما مخزن BSA المخزن المؤقت المعد حديثا.
  6. إعداد العيش / الميت بقعة العمل التخفيف. أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون البقع الحية / الميتة المعاد تشكيله إلى 360 ميكرولتر D-PBS وقم بتخزينه في الظلام (على سبيل المثال ، درج أو صندوق) في درجة حرارة الغرفة. تحضير 50 ميكرولتر من تخفيف العمل لكل عينة.

3. التروية

  1. ضع المحلول الملحي مع الهيبارين على الجليد.
  2. قم بتشغيل الأكسجين ، واضبط كرة مؤشر مقياس التدفق على نظام تبخير التخدير الحيواني الصغير على 1 لتر / دقيقة. تأكد من وجود ضغط كاف للأكسجين والأيزوفلوران.
  3. اضبط قرص المبخر على 3.5٪ (للحث والصيانة).
  4. قم بتعبئة خطوط مضخة التروية بمحلول ملحي / هيبارين. اضبط السرعة على 6 مل / دقيقة.
  5. ضع الماوس في غرفة الحث ، وقم بتشغيل جهاز التنفس ، وانتظر عدة دقائق حتى لا يستجيب الماوس. تأكد من عمق كاف للتخدير من خلال عدم وجود سحب دواسة إلى قرصة ضارة.
  6. ضع الماوس على ظهره على صينية التشريح مع أنفه في مخروط الأنف. إجراء تأكيد ثانوي للتخدير الكامل من خلال عدم وجود سحب دواسة إلى قرصة ضارة. دبوس جميع الكفوف الأربعة على الدرج.
  7. رش بطن الحيوان مع 20 ٪ من الإيثانول.
  8. باستخدام ملقط ، قرصة أسفل البطن ورفع الجلد. استخدم المقص لقطع الفراء والجلد إلى أسفل القفص الصدري.
  9. قم بعمل شقين قطريين من أسفل القفص الصدري باتجاه كل كتف.
  10. استئصال الحجاب الحاجز بعناية (تجنب الرئتين والقلب). استئصال القفص الصدري لفضح القلب.
  11. اقطع بعناية أي نسيج ضام حول القلب.
    ملاحظة: الخطوات 3-10-3-11 حاسمة؛ أداء بكفاءة وبراعة.
  12. استخدم المقص لقص الأذين الأيمن (الفص الداكن في الجزء العلوي الأيسر من القلب). أوقف تدفق الأيزوفلوران إلى التنفس.
  13. امسك القلب ثابتا باستخدام الملقط. مع شطبة إبرة الفراشة متجهة لأعلى ، اخترق البطين الأيسر مع الحفاظ على مستوى الإبرة وموازية للحيوان.
  14. امسك الإبرة في مكانها ، وقم بتشغيل المضخة ، وقم برش ما لا يقل عن 30 مل من محلول الملح / الهيبارين حتى يصبح السائل الذي يغادر القلب غير شفاف ويكون لون الكبد والرئتين شاحبا.
    ملاحظة: الخطوات 3-13-3-14 حاسمة؛ أداء بكفاءة وبراعة.
  15. قم بإيقاف تشغيل المضخة وإزالة الإبرة ونقل الماوس إلى منطقة التشريح.

4. تشريح

  1. باستخدام مقص جراحي كبير ، قطع رأس الرأس.
  2. قطع الفراء من الجزء الخلفي من الرأس حتى العينين. قشر الجلد مرة أخرى لكشف الجمجمة.
  3. قص الجمجمة بين العينين. قم بإجراء قطعتين في الجزء الخلفي من الجمجمة ، في وضعيتي الساعة 10 و 2 ، ثم قم بإجراء قطع طويل واحد (حافظ على النصائح لتجنب إتلاف الدماغ) على طول الخط السهمي الأوسط للجمجمة إلى القطع الأصلي بين العينين.
  4. استخدم الملقط لتقشير نصفي الجمجمة بعيدا إلى الجانبين. استخدم ملعقة لإزالة الدماغ ووضعها في طبق بتري زجاجي 60 مم على الجليد مملوء ب D-PBS البارد (الشكل 1).
  5. استخدم مشرطا أو ماكينة حلاقة لفصل كل نصف كرة. ثم قم بإزالة المصابيح الشمية والمخيخ.
  6. استخدم الملقط لإزالة الدماغ المتوسط حتى يتعرض الحصين.
  7. تأمين الدماغ مع الملقط. باستخدام مجموعة ثانية من الملقط ، قم بمضايقة الحصين بلطف من كل نصف كرة ، وانقل كلا من الحصين إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على D-PBS بارد.
  8. ضع أنبوب العينة الذي يحتوي على اثنين من الحصين من الماوس على الجليد.

5. تحضير مزيج الإنزيم 1 و 2 لكل عينة

ملاحظة: بالنسبة للأحجام الأكبر من 2 مل ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 مل ؛ للأحجام ، 200 ميكرولتر - 2 مل ، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر ؛ للأحجام ، 21-199 ميكرولتر ، استخدم ماصة 200 ميكرولتر ؛ للأحجام ، 2-20 ميكرولتر ، استخدم ماصة 20 ميكرولتر ؛ للأحجام التي تقل عن 2 ميكرولتر ، استخدم ماصة 0-2 ميكرولتر.

  1. لكل عينة، قم بإذابة أليكوت واحد لكل من إنزيم P وإنزيم A في درجة حرارة الغرفة.
  2. بالنسبة لمزيج الإنزيم 1 ، اجمع بين 50 ميكرولتر من إنزيم P و 1900 ميكرولتر من Buffer Z في أنبوب C المسمى (جدول المواد).
  3. بالنسبة لمزيج الإنزيم 2 ، أضف 20 ميكرولتر من Buffer Y إلى أليكوت 10 ميكرولتر المذاب من إنزيم A.

6. بروتوكول تفكك الدماغ الكبار17

ملاحظة: عند العمل مع العينات، يجب وضع الأنابيب في رف أنبوب في درجة حرارة الغرفة بينما يبقى BSA و D-PBS على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. قم بتشغيل المنفصل.
  2. استخدم الملقط لنقل قطع أنسجة الحصين إلى الأنبوب C.
  3. نقل 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 إلى الأنبوب C. قم بلف الغطاء حتى يشعر بالتوتر، ثم شده حتى ينقر.
  4. ضع الأنبوب C رأسا على عقب في موضع المنفصل ؛ سيتم تعيين الحالة المحددة للعينة (الشكل 2). قم بتأمين السخان فوق الأنبوب C.
  5. اضغط على أيقونة المجلد، وحدد مجلد المفضلة ، وقم بالتمرير إلى البرنامج 37C_ABDK_02 وحدده. انقر فوق موافق لتطبيق البرنامج على جميع أنابيب C المحددة ، ثم انقر فوق ابدأ (الشكل 2).
  6. تسمية أنبوب مخروطي واحد 50 مل لكل عينة.
  7. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل وابلل ب 2 مل من المخزن المؤقت BSA.
  8. عند الانتهاء من البرنامج ، قم بإزالة السخان وأنبوب C من المنفصل.
  9. أضف 4 مل من المخزن المؤقت BSA إلى العينة وطبق الخليط على مصفاة الخلية على الأنبوب المخروطي 50 مل.
  10. أضف 10 مل من D-PBS إلى الأنبوب C ، وأغلقه ، وقم بتدوير المحلول بلطف. ضعه على مصفاة الخلية على الأنبوب المخروطي 50 مل.
  11. تخلص من مصفاة الخلايا والأنبوب C. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم ، استنشق وتخلص من supernatant.

7. إزالة الأنقاض

  1. أعد تعليق الكريات ب 1550 ميكرولتر من D-PBS البارد وانقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  2. أضف 450 ميكرولتر من محلول إزالة الحطام البارد وقم بماصة لأعلى ولأسفل (لا دوامة).
    ملاحظة: حل إزالة الحطام هو كاشف في مجموعة التفكك التجارية Brian17.
  3. تراكب بلطف 1 مل من D-PBS الباردة أعلى تعليق الخلية ، مع الحفاظ على الطرف على جدار الأنبوب المخروطي. كرر حتى يكون إجمالي التراكب 2 مل.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة؛ أداء بكفاءة وبراعة.
  4. جهاز طرد مركزي عند 3000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع كامل وفرامل كاملة.
    ملاحظة: إذا لم يتم فصل المراحل بشكل واضح، كرر الخطوات 7.2-7.3. جهاز طرد مركزي للمرة الأخيرة عند 1000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. وينبغي أن يتألف التعليق الآن من ثلاث طبقات متميزة (الشكل 3). شفط الطبقة العليا. امسح طرف الماصة ذهابا وإيابا لاستنشاق الطبقة الوسطى البيضاء. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الطبقة الوسطى دون إزعاج الطبقة السفلية.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة؛ أداء بكفاءة وبراعة.
  6. أضف 2 مل من D-PBS البارد وماصة لأعلى ولأسفل للخلط.
  7. جهاز طرد مركزي عند 1000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع كامل وفرامل كاملة. شفط والتخلص من supernatant. أعد تعليق الكريات في 1 مل من المخزن المؤقت BSA.
    ملاحظة: يمكن إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت المناسب ثم وضع علامة مغناطيسية عليها وعزلها استعدادا لتسلسل الخلية الواحدة في هذه المرحلة.

8. عدد الخلايا

  1. قم بإجراء عد الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لعداد الخلايا المتاح (يشار إلى خيار واحد في جدول المواد)

9. بقعة حية / ميتة

  1. جهاز طرد مركزي 900 ميكرولتر المتبقية (من 7.7) عند 1000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع كامل وفرامل كاملة.
  2. أثناء دوران العينة، ضع علامة على أنبوب تدفق واحد لكل عينة ولفه في رقائق معدنية للحد من التعرض للضوء.
  3. شفط والتخلص من supernatant.
  4. أعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من البقعة الحية / الميتة المخففة (المعدة مسبقا).
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في إعداد الإضاءة المنخفضة. أطفئ أضواء الغرفة العلوية لتحقيق ذلك.
  5. انقل كل عينة إلى أنبوب التدفق المسمى المقابل واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 8-10 دقائق في الظلام (على سبيل المثال ، درج أو صندوق).
  6. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت BSA وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع كامل وفرامل كاملة.
  7. شفط والتخلص من supernatant.
    ملاحظة: قد لا تكون الكريات مرئية. اترك كمية صغيرة من المخزن المؤقت وراءها حتى لا تستنشق الكريات عن غير قصد. يمكن إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت المناسب ، وحظرها ، وتلوينها بالأجسام المضادة الخاصة بالخلايا في هذه المرحلة. انظر الملف التكميلي 1 للاطلاع على نموذج البروتوكول18.

10. التثبيت (اختياري)

  1. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من 1٪ PFA (أعدت مسبقا). احتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  2. يغسل عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من D-PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. شفط السوبرناتانت.
    ملاحظة: قد لا تكون الكريات مرئية. اترك كمية صغيرة من المخزن المؤقت وراءها حتى لا تستنشق الكريات عن غير قصد.
  4. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من D-PBS وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.

11. قياس التدفق الخلوي

  1. قم بتسمية أغطية المرشح على الأنابيب الجديدة.
  2. باستخدام ماصة 1 مل ، ماصة كل عينة على غطاء المرشح.
  3. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 200 × g عند 4 درجات مئوية ، مما يسمح فقط لجهاز الطرد المركزي بالوصول إلى 200 × g قبل إيقاف التشغيل.
  4. انتقل إلى قلب قياس التدفق الخلوي لتحليل المصب.

النتائج

وتمت معالجة العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي في منشأة أساسية، وتم تقييم البيانات الناتجة باستخدام حزمة برمجيات لتحليل التدفق. في السابق ، تم تحليل ضوابط التعويض - وصمة عار حية / ميتة والتحكم السلبي. إذا تم استخدام العديد من الفلوروكرومات ، فيجب إعداد عناصر تحكم فلورية ناقص واحدة (FMO) وع...

Discussion

تتطلب عدة خطوات في بروتوكول التفكك العصبي هذا تقنية بارعة وبراعة - تروية ، وطموح فائق ، وإزالة المايلين. طوال عملية التروية ، يجب أن تظل الأعضاء الداخلية سليمة (بصرف النظر عن إزالة الحجاب الحاجز وقطع القلب) ؛ وهذا يشمل تجنب الغرف العلوية للقلب باستخدام إبرة الفراشة. في حين أن كمية المياه ال?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر إيمي روجرز على توفير التدريب العملي والدعم المستمر للمنتجات. نشكر الدكتورة أماندا بيرك على استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتوضيح المناقشات المستمرة. نشكر ميريديث جوهايم ومجموعة UAMS Science Communication Group على التحرير النحوي والتنسيق لهذه المخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R25GM083247 و NIH 1R01CA258673 (A.R.A).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge TubesFisher Scientific02-682-003Basix, assorted color
15 mL Falcon TubesBecton Dickinson Labware Europe352009Polystyrene
25 mL Serological PipetsFisher Scientific14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test TubeFalcon352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle SystemCorning431097
70 μm cell strainerFisher Scientific08-771-2
Adult Brain Dissociation KitMiltenyi Biotec 130-107-677Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum FoilFisher Scientific01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969Miltenyi Biotec130-116-246
Anti-Myelin Basic ProteinSigma-AldrichM3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2BMiltenyi Biotec130-117-394
BD LSRFortessaBD
BSASigma-AldrichA7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592Miltenyi Biotec130-113-810
CD31 AntibodyMiltenyi Biotec130-111-541
Ceramic Hot Plate StirrerFisher Scientific11-100-100SH
Dimethyl SulfoxideFisher ScientificBP231-100
EthanolPharmco by Greenfield Global111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-432-22
Fine Scissors - SharpFine Science Tools14060-09Perfusion
FlowJoBD(v10.7.0)
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Gibco DPBS (1X)ThermoFisher Scientific14190144
Glass BeakerFisher Scientific02-555-25A
Heparin sodiumFresenius Kabi504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisherL34965
Magnetic Stir BarFisher Scientific14-513-51
Noyes Spring ScissorsFine Science Tools15012-12Dissection
ParaformaldehydeSigma-Aldrich441244-3KGPrilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10Rainin30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10Rainin30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8Rainin30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)Rainin30386597
RBXMO FITC XADSFisher ScientificA16167
Round Ice Bucket with LidFisher Scientific07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer CapFalcon100-0087
S1 Pipet FillersThermoFisher Scientific9541
Spatula & ProbeFine Science Tools10090-13Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"TermunoSV-23BLKButterfly needle
Test Tube RackFisher Scientific14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR CentrifugeThermoFisherdiscontinuedOr other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic PumpFisher Scientific13-876-2Low-flow model
VetFlo Starter Kit for MiceKent ScientificVetFlo-MSEKITAnesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia SystemKent ScientificVetFlo-1210S0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability AnalyzerBeckman Coulter Life Sciences731196Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample VialsBeckman Coulter Life Sciences383721Cell Counting

References

  1. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. . The Hippocampus Book. , (2007).
  2. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
  3. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).
  5. Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
  6. Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
  7. Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
  8. Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
  9. Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
  10. Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
  11. Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, 137-145 (2015).
  12. Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
  13. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
  14. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
  15. Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020)
  16. Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021)
  17. Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
  18. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
  19. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
  20. Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
  21. Recommended controls for flow cytometry. Abcam Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021)
  22. . Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021)
  23. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  24. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
  25. Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
  26. Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
  27. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
  28. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
  29. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  30. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
  31. O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
  32. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved