JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم الدهون القائمة على قياس الطيف الكتلي للبندقية لقطة كمية حساسة لمجموعة واسعة من فئات الدهون في وقت واحد في قياس واحد من أنسجة القوارض المختلفة.

Abstract

تلعب الليبيدات دورا حيويا كمكونات أساسية لجميع الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة. جعلت التحسينات التكنولوجية المستمرة في قياس الطيف الكتلي من علم الدهون أداة تحليلية قوية لمراقبة تركيبات الدهون في الأنسجة في حالات الاستتباب وكذلك المرض. تقدم هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة لطريقة تحليل دهون البندقية التي تدعم الكشف المتزامن والقياس الكمي لبضع مئات من أنواع الدهون الجزيئية في عينات مختلفة من الأنسجة والسوائل الحيوية ذات الإنتاجية العالية. تستفيد هذه الطريقة من الحقن المباشر الآلي لتدفق النانو لمستخلص دهني كلي تم رفعه بمعايير داخلية موسومة دون فصل كروماتوغرافي في أداة قياس الطيف الكتلي عالية الدقة. بدءا من كميات أقل من ميكروغرام من أنسجة القوارض ، يستغرق تحليل MS 10 دقائق لكل عينة ويغطي ما يصل إلى 400 دهون من 14 فئة دهنية في أنسجة رئة الفئران. الطريقة المعروضة هنا مناسبة تماما لدراسة آليات المرض وتحديد وقياس المؤشرات الحيوية التي تشير إلى السمية المبكرة أو الآثار المفيدة داخل أنسجة القوارض.

Introduction

يعرف دخان السجائر (CS) بأنه عامل خطر رئيسي مرتبط بتطور الأمراض الالتهابية المزمنة في الرئة ، بما في ذلك سرطان الرئة والتهاب الشعب الهوائية ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)1. بالإضافة إلى تأثير الرئة ، يلعب التعرض ل CS دورا مهما في تطور أمراض أخرى مثل مرض الشريان التاجي تصلب الشرايين وأمراض الأوعية الدموية الطرفية1. أمراض القلب والأوعية الدموية ، جنبا إلى جنب مع مرض الانسداد الرئوي المزمن ، هي الأسباب الرئيسية الأولى والثالثة للوفاة في جميع أنحاء العالم ، على التوالي. اعتمدت نهج تقييم المخاطر السمية تاريخيا على استخدام النماذج الحيوانية مثل القوارض. في الجسم الحي ، تستخدم نماذج الفئران والفأر للأنف فقط أو الجسم بالكامل بشكل شائع لدراسة الآثار طويلة المدى للتعرض ل CS.

على سبيل المثال ، بشكل عام ، يؤدي التعرض للدخان لمدة 6 أشهر إلى حدوث تشوهات نسيجية ووظيفية في رئتي الفئران تحاكي تلك الخاصة بالأمراض البشرية ، بما في ذلك انتفاخ الرئة وإعادة تشكيل مجرى الهواء وارتفاع ضغط الدم الرئوي ، على الرغم من أن التغييرات خفيفة نسبيا مقارنة بتلك التي لوحظت في المدخنين البشريين على المدىالطويل 2. في كل من الأنسجة الحيوانية والبشرية ، لاحظت الدراسات مجموعة واسعة من التغيرات الجزيئية استجابة للتعرض ل CS ، بما في ذلك استجابات الإجهاد التأكسدي ، والالتهاب ، وتغيرات الأنسجة الهيكلية 3,4. ليس من المستغرب أن يكون للتعرض ل CS تأثير بعيد المدى على دهون الرئة ، بما في ذلك التأثيرات على الدهون الخافضة للتوتر السطحي ، ووسطاء إشارات الدهون ، والدهون الهيكلية4،5،6.

لتوصيف التغيرات في الدهون السائبة الناجمة عن التعرض طويل الأمد ل CS لرئتي الفأر ، أجرينا تحليلا سريعا وكميا لقياس الطيف الكتلي بالتسريب المباشر للبندقية. بعد إدخال طريقة الدهون في البندقية في 20057 ، تم استخدام هذه الطريقة بشكل فعال لتوسيع معرفتنا حول التمثيل الغذائي الخلوي للدهون8،9،10 في أنظمة نموذجية مثل الخميرة 11 ، Caenorhabditis elegans12 ، و Drosophila melanogaster13 ، وكذلك في مجموعة واسعة من أنواع عينات الثدييات مثل خطوط الخلايا 14 ، 15,16 مختلف الإنسان17,18 وأنسجة القوارض 19,20 وسوائل الجسم21,22.

على مدى العقود الماضية ، كشفت الدراسات عن تعقيد الاستجابات الخلوية للتغيرات البيئية ، والتي تشمل الآلاف من البروتينات والدهون والأيضات المترابطة. وقد أوضح ذلك أن استخدام أحدث التقنيات التحليلية أمر ضروري للحصول على رؤية متعمقة للآليات الجزيئية وللكشف عن الحجم الكامل للتأثيرات الفسيولوجية الخارجية. في هذا السياق ، يمكن أن تضيف بصمات الدهون الكمية الشاملة التي تنتجها مناهج الدهون في البندقية بشكل فعال إلى معرفتنا حول التمثيل الغذائي الخلوي للدهون8،9،10.

فيما يتعلق بالتعرض ل CS كعامل خطر للعديد من الأمراض ، اعتمدت مناهج تقييم المخاطر السمية تاريخيا على استخدام النماذج الحيوانية مثل القوارض. يوفر Shotgun lipidomics MS أداة تحليلية سريعة وحساسة وكمية لتقييم اضطراب الدهون في العديد من أنواع العينات. الميزة الفريدة لعلم الدهون في البندقية هي التحليل الآلي للحقن المباشر لمستخلص الدهون الكلي - المسنن بمعايير داخلية موسومة - بدون فصل كروماتوغرافي إلى أداة MS عالية الدقة باستخدام رقاقة نانوية موصلة تولد رذاذ نانوي بالتأين الكهربائي (ESI)23.

توفر معلومات نسبة الكتلة إلى الشحن التي يتم الحصول عليها في وقت واحد في وضع MS1 البصمة الدهنية الكلية لجميع الدهون الداخلية السليمة. اختياريا ، يوفر وضع MS2 / MS3 ، الذي يتم فيه تجزئة جزيئات الدهون الأصلية وتحليلها ، معلومات هيكلية إضافية. يتطلب تحليل البيانات برامج متخصصة ويتضمن فك التفاف الأطياف وتخصيصات الذروة في الأطياف المجمعة التي تؤدي إلى تحديد الدهون وتوضيح التركيب الكيميائي المفترض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء القياس الكمي المطلق عن طريق رفع خليط المعايير الداخلية المسمى الذي يحتوي على معيار دهني واحد على الأقل لكل فئة دهنية ذات أهمية. بشكل عام ، مع التقنية الحالية ، يمكن أن يغطي تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد الذي يستغرق بضع دقائق لكل عينة تحديد وتقدير ما يصل إلى 800 دهون من 14 فئة دهنية24 في أنسجة القوارض.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات في منشأة معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية ومرخصة من قبل هيئة الأغذية الزراعية والبيطرية في سنغافورة ، بموافقة من لجنة مؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات وامتثالا للجنة الاستشارية الوطنية لإرشادات أبحاث المختبر بشأن رعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية (NACLAR ، 2004).

1. جمع العينات

  1. إجراء تشريح رئة الفأر بعد 3 أشهر و 6 أشهر من التعرض للفئران ApoE− / − . اجمع الأنسجة بعد 16-24 ساعة من التعرض ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية قبل بدء سير عمل الدهون. ضمان جمع ما مجموعه تسع عينات من كل مجموعة تشريح "omics".

2. الأنسجة - سحق العينات

  1. تحضير المطرقة المغناطيسية والمواد الاستهلاكية لطحن الأنسجة. أكياس الأنسجة Precool ، والملقط ، وأنابيب نقل الأنسجة المغطاة بأغطية ، وملعقة بلاستيكية "V" ، وأنابيب تجميع بلاستيكية سعة 2 مل على الثلج الجاف. قم بتثبيت حامل الأنبوب المقابل على أداة مطرقة مغناطيسية. قم بتشغيل المطرقة المغناطيسية واضبط قوة التأثير على عالية.
  2. تحميل العينة في كيس الأنسجة ؛ أدخل العينة من خلال الفتحة العلوية لكيس الأنسجة باستخدام ملقط مبرد مسبقا إذا لزم الأمر. ضع العينة في وسط الحقيبة المرنة بعيدا عن الحواف.
  3. أغلق كيس الأنسجة عن طريق شد أنبوب تجميع مبرد مسبقا على الجزء العلوي من كيس المناديل.
  4. قم بتجميد العينة عن طريق غمر الحقيبة المرنة في النيتروجين السائل لمدة 10 ثوان.
  5. تنفيس أنبوب التجميع. قم بفك الأنبوب للحصول على 1/4 دورة للتنفيس لتجنب تمزق الحقيبة عند اصطدام المطرقة المغناطيسية.
  6. قم بتحميل كيس الأنسجة المجمد على المطرقة المغناطيسية.
  7. ضع المطرقة المغناطيسية بالضغط على زر التنشيط لسحق العينة. إذا بقيت قطع الأنسجة غير المسحوقة في الكيس ، فقم بتجميد العينة في النيتروجين السائل مرة أخرى وكرر ذلك للحصول على تأثير ثان.
  8. قم بإزالة كيس الأنسجة من المطرقة المغناطيسية ، مع الاحتفاظ بالعينة المسحوقة في الأسفل. لمنع العينة من الذوبان ، قم بتجميدها مرة أخرى على الفور.
  9. انقل العينة إلى أنبوب تجميع. اقلب الأنبوب بسرعة بحيث يكون كيس الأنسجة في الأعلى ، واضغط على الحقيبة لنقل جزيئات الأنسجة إلى أسفل أنبوب التجميع.
    ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة بسرعة لتجنب ذوبان الأنسجة.
  10. انقل حصة الأنسجة 10 ملغ إلى أنبوب سعة 2 مل لمزيد من التحليل الشحمي وقم بتخزين العينة عند -80 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ خطوات أخرى.

3. تجانس الأنسجة

  1. قم بتشغيل أداة محلل الأنسجة واضبط تردد الاهتزاز على 30 هرتز ومدة الاهتزاز على 2 دقيقة. تحضير محلول عازلة لتجانس الأنسجة: 150 مللي متر بيكربونات الأمونيوم في الماء ، مع درجة حموضة ~ 8.2.
  2. أخرج العينات من مجمد التخزين ، وضعها على الثلج ، وأضف أربع حبات من الفولاذ المقاوم للصدأ في الأنابيب التي تحتوي على مسحوق الأنسجة. أضف 0.5 مل من 150 mM من بيكربونات الأمونيوم العازلة لكل عينة.
  3. ضع أنابيب العينة في حوامل محلل الأنسجة. موازنة كلا الحاملين بنفس عدد الأنابيب. ثبت الحوامل في ذراع عقد محلل الأنسجة. تعطيل الأنسجة.
  4. ضع الأنابيب على الثلج وتحقق بصريا من عدم وجود مجاميع الأنسجة المتبقية في الأنبوب. إذا كان اضطراب الأنسجة غير مكتمل (يتم رؤية الركام) ، كرر عملية الاضطراب عن طريق إجراء دورة علاج أخرى. ضع العينات على الثلج.
  5. قم بإنشاء قسمة 1 من 100 ميكرولتر من العينة في أنبوب سعة 1.5 مل مخصص لتحديد البروتين. جهاز طرد مركزي عند 18200 × جم لمدة 5 دقائق عند 10 درجات مئوية.
  6. تحديد محتوى البروتين في القسمة 1 بواسطة مقايسة برادفورد (انظر القسم 4). تخزين العينات على الجليد.
  7. قم بإنشاء حصة 2 من 20-100 ميكرولتر من تجانس المخزون في أنبوب دقيق جديد سعة 2 مل لاستخراج الدهون (انظر القسم 5). إذا لم يتم تحليل العينات على الفور ، احتفظ بها على الجليد حتى يتم إجراء الاستخراج.
    ملاحظة: يجب تحديد حجم الاستخراج النهائي على أساس إجمالي كمية البروتين. يجب أن يكون في حدود 0.015-0.045 ملغ من البروتين لكل إجمالي القسامة.

4. مقايسة تحديد بروتين برادفورد

ملاحظة: يجب أن تكون عينات الدراسة عشوائية قبل بداية التحليل ، ويتم احترام التوزيع العشوائي لجميع خطوات معالجة العينة.

  1. تمييع القسمة الطرد المركزي 1 طاف 2x مع عازلة بيكربونات الأمونيوم.
    ملاحظة: يعتمد عامل التخفيف على تركيز تجانس الأنسجة. للحصول على حلول أكثر تركيزا ، قم بتطبيق عامل أعلى بحيث يقع التركيز المحدد في النطاق الديناميكي للفحص.
  2. تحضير منحنى قياسي لألبومين مصل الأبقار (BSA) وفقا للجدول 1. دوامة الأنابيب القياسية. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 18200 × جم لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  3. من الأنابيب القياسية المعدة مسبقا ، انقل 6 ميكرولتر لكل من الفراغ والمعايير إلى لوحة مسطحة القاع 96 بئرا وفقا لتخطيط اللوحة الموضح في الشكل 1.
  4. انقل العينات المعدة مسبقا إلى اللوحة ذات القاع المسطح المكونة من 96 بئرا وفقا لتخطيط اللوحة الموضح في الشكل 1.
  5. أضف 250 ميكرولتر من كاشف برادفورد إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات واخلطها. احتضان لمدة 5 دقائق.
  6. قم بقياس الامتصاص عند طول موجي 595 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
  7. احسب تركيزات البروتين في القسمة بناء على المنحنى القياسي.
    ملاحظة: يجب مراعاة عامل التخفيف المستخدم في بداية الإجراء عند حساب تركيزات البروتين.

5. استخراج بوم

ملاحظة: تجنب استخدام الأنابيب البلاستيكية منخفضة الربط لاستخراج الدهون ، لأن المذيبات العضوية القوية تطلق الملدنات وتخلق خلفية قوية أثناء تحليل العينة.

  1. تحضير أنابيب 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم في كل أنبوب من إجمالي الفراغ (TB) ، والفراغ القياسي الداخلي (ISB) ، وعينات مراقبة الجودة (QC) ، مع الأخذ في الاعتبار يتم وضع عينة واحدة لمراقبة الجودة بين كل مجموعة من 10 عينات. احتفظ بجميع العينات على الثلج.
  2. أضف 10 ميكرولتر من البلازما البشرية المجمعة إلى جميع عينات مراقبة الجودة. سبايك 10 ميكرولتر من المحلول القياسي الداخلي في جميع ISB و QC وعينات الدراسة (أي جميع العينات باستثناء السل).
    ملاحظة: بالنسبة لمواد مراقبة الجودة، استخدم أي بلازما K2EDTA مجمعة متوفرة تجاريا. تحديد تركيز الدهون في البلازما المجمعة باستخدام البروتوكول المذكور عند الاستلام والاحتفاظ بهذه النطاقات كمراجع لجميع التحليلات التي تستخدم فيها مادة مراقبة الجودة. استخدم بلازما NIST فقط للتطبيقات الأكثر استهدافا أو للتحقق من الطريقة العالمية ، حيث يجب معالجة دقة الفحص.
  3. أضف 300 ميكرولتر من -20 درجة مئوية خليط البيوتانول / الميثانول (3/1 ، v / v) لكل عينة. يرج على حرارة 450 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري.
  4. أضف 300 ميكرولتر من خليط أسيتات الهيبتان / الإيثيل (3/1 ، v / v). يرج على حرارة 450 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري.
  5. أضف 300 ميكرولتر من خليط حمض الأسيتيك 1٪. رج لمدة 5 دقائق عند 450 × جم في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري. جهاز طرد مركزي عند 2800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل 360 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى أنبوب قفل ذاتي جديد سعة 2 مل 2.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي استخراج السائل السائل إلى تغيير مواضع حدود الطور بطريقة تعتمد على العينة ، مما قد يؤدي إلى تباين طفيف في الحجم للمرحلة العليا. اضبط مستوى صوت التجميع للمرحلة العليا إذا لزم الأمر.
  6. أضف 320 ميكرولتر من أسيتات الهيبتان / الإيثيل (3/1 ، v / v) إلى أنبوب طور الماء 1. يرج على حرارة 450 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري. جهاز طرد مركزي عند 2800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل 320 ميكرولتر من المرحلة العليا وادمجها مع الكسر من الخطوة 5.11.
    ملاحظة: اضبط مستوى صوت التجميع للمرحلة العليا إذا لزم الأمر.
  7. أضف 250 ميكرولتر من أسيتات الهيبتان / الإيثيل (3/1 ، v / v) إلى مرحلة الماء في الأنبوب 1. يرج على حرارة 450 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري. جهاز طرد مركزي عند 2800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل 200 ميكرولتر من المرحلة العليا والجمع مع الكسور من الخطوة 5.11 والخطوة 5.15 في الأنبوب 2.
    ملاحظة: اضبط مستوى صوت التجميع للمرحلة العليا إذا لزم الأمر.
  8. يتبخر حتى يجف عند 35 درجة مئوية في مكثف مفرغ.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات المجففة في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى التحليل ، إذا لزم الأمر.
  9. يعاد إذابته في 300 ميكرولتر من محلول مزيج MS (7.5 مللي متر من أسيتات الأمونيوم في الأيزوبروبانول / الميثانول / الكلوروفورم ، محلول 4: 2: 1). دوامة كل أنبوب لمدة 5 ثوان لضمان إذابة كل شيء. أجهزة الطرد المركزي عند 18200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. قم بنقل قسمة 50 ميكرولتر إلى لوحة ميكرولتر وفقا لتخطيط اللوحة في الشكل 2 لتحليل وضع التأين الإيجابي (الأعمدة 1-6) وتخفيفها باستخدام 50 ميكرولتر من محلول مزيج MS.
  11. نقل حصة 20 ميكرولتر إلى لوحة MTP وفقا لتخطيط اللوحة في الشكل 2 لتحليل وضع التأين السلبي (الأعمدة 7-12) وتخفيفها ب 80 ميكرولتر من مزيج MS. لف الطبق بورق القصدير واحفظه عند 4 درجات مئوية قبل التحليل.

6. تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد

  1. معايرة مطياف الكتلة (MS) في كل من الأوضاع الإيجابية والسلبية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة قبل 5 أيام أو أقل من التحليل.
  2. قم بتثبيت مصدر النانو للتسريب المباشر مقدما ، مع التأكد من محاذاته بشكل صحيح مع شعرية النقل الخاصة بمرض التصلب العصبي المتعدد. قم بتثبيت شريحة فوهة 4.1 ميكرومتر في حامل الشريحة وقم بتكوينها في البرنامج.
  3. استخدم المعلمات التالية لإعداد طريقة الوضع الإيجابي والسلبي: ضغط الغاز 1.25 رطل / بوصة مربعة ؛ مصدر الجهد من 1.1 كيلو فولت ؛ 5 ميكرولتر من حجم حقن العينة ؛ إغلاق اتصال الإخراج Rel1 لمدة 2.5 ثانية ؛ 5 دقائق من وقت التسليم ؛ تبريد اللوحة عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بإعداد قائمة انتظار تسلسل التحليل لروبوت التسريب المباشر في الوضع الإيجابي.
  5. قم بإعداد طريقة MS للوضع الإيجابي باستخدام إعدادات MS التالية:
    1. اضبط درجة حرارة الشعيرات الدموية على 250 درجة مئوية ومستوى التردد اللاسلكي للعدسة S على 65.0. قم بإجراء اكتساب MS للمسح الكامل من 0 إلى 1 دقيقة في نطاق 550-1000 م / ض بدقة 140000 مع التحكم التلقائي في الكسب من 1 ×106 والحد الأقصى لوقت الحقن 50 مللي ثانية. تطبيق كتلة القفل 680.48022.
    2. اضبط طريقة اكتساب MS / MS المستقلة عن البيانات بين النطاق الزمني 1 و 5 دقائق بدقة 17500 مع كتلة أولى ثابتة تبلغ 250 م / ض. استخدم التحكم التلقائي في الكسب ل MS2 عند 1 × 105 وأقصى وقت حقن يبلغ 64 مللي ثانية ، وطاقة تصادم تبلغ 20 NCE ، ونافذة عزل تبلغ 1 م / ض. استخدم قائمة كتلة التضمين من 550 إلى 1000 م / ض ، مع خطوة كتلة 1 دا.
  6. للاكتساب في الوضع السلبي ، اضبط درجة حرارة الشعيرات الدموية على 250 درجة مئوية ومستوى S-Lens RF عند 65.0 في ملف MS tune.
    1. استخدم إعدادات طريقة MS التالية: وضع اكتساب المسح الكامل من 0 إلى 1 دقيقة بدقة 140000 تغطي نطاق 400-940 م / ض ، التحكم الآلي في الكسب من 1 × 106 ؛ الحد الأقصى لوقت الحقن 50 مللي ثانية ؛ استخدم كتلة قفل تساوي 529.46262.
    2. تعيين اكتساب MS2 في وضع DIA بين 1 و 5 دقائق من التشغيل بدقة 17500 مع كتلة أولى ثابتة تبلغ 150 م / ض ؛ التحكم الآلي في الكسب من 1 × 105 ؛ 64 مللي ثانية من الحد الأقصى لوقت الحقن ؛ و 35NCE من طاقة الاصطدام. استخدم قائمة كتلة التضمين من 400 إلى 940 بخطوة كتلة 1 دا.
  7. قم بإنشاء قائمة انتظار تسلسل التحليل في برنامج MS في الوضع الإيجابي . انتظر حتى يتم تشغيل الحصول على العينة بواسطة إشارة إغلاق اتصال قادمة من روبوت التسريب المباشر لكل عينة.
  8. عند اكتمال تحليل الوضع الإيجابي ، قم بإنشاء قائمة انتظار التسلسل لروبوت التسريب المباشر في الوضع السلبي .
  9. قم بإعداد قائمة انتظار تسلسل التحليل في برنامج MS في الوضع السلبي .

7. معالجة البيانات

  1. لتحويل ملفات البيانات من الوضعين الموجب والسالب من تنسيق .raw إلى تنسيق .mzML ، استخدم برنامج المحول.
    ملاحظة: يجب تحويل ملفات البيانات من الوضعين الإيجابي والسلبي بشكل منفصل (بسبب إعدادات الاكتساب المختلفة وعتبة الضوضاء المختلفة).
    1. املأ الإعدادات التالية لإجراء تحويل الملف: عامل عتبة الضوضاء هو 3 و 5 ل MS و MS2 ، على التوالي ؛ قم بتنشيط وظيفة إزالة الضوضاء لكل من MS و MS2 ، وضغط البيانات ، ومتوسط عمليات مسح MS2 ، واختيار الذروة. تعيين عتبات TIC للأوضاع الإيجابية والسلبية (على سبيل المثال ، 10000 و 5000 ؛ ليتم تحديدها بناء على مستوى الضوضاء لعينة معينة تنتجها أداة معينة). إنشاء تقارير XLC و PDF في نهاية المعالجة.
  2. إجراء تحديد الدهون. حدد معلمات إعدادات استيراد الملفات التالية (مثال): نافذة التحديد ±0.5 Da (يعتمد على نافذة التحديد في طريقة MS) ؛ النطاق الزمني 2-300 ثانية (يعتمد على وقت المسح في طريقة MS) ؛ لا توجد كتل معايرة ل MS و MS2 ؛ نقل وتقريب نطاق الكتلة من ملفات البيانات الوصفية لبرنامج Peak by Peak (الكتلة الدنيا [MS]) و (الكتلة الدنيا [MS2]) ؛ تفاوت 3 جزء في المليون و10 جزء في المليون ل MS و MS2 ، على التوالي ؛ احتفظ بحقل عتبة MS و MS2 ومرشح التردد وإزاحة MS1 و PMO فارغا ؛ اختيار التصحيح النظيري لنظامي MS وMS2؛ نقل تدرج الدقة من ملف البيانات الوصفية للمحول ك (الدقة الخطية الملائمة [MS]) وك (الدقة الخطية الملائمة [MS2]).
    ملاحظة: يجب إجراء تحديد الدهون في الوضعين الإيجابي والسلبي بشكل منفصل بسبب إعدادات الاكتساب المختلفة.
  3. بعد استيراد البيانات ، انتقل إلى قائمة التشغيل وقم بتحميل ملفات MFQL لتحديد الدهون.
    ملاحظة: للحصول على معلومات مفصلة عن هيكل MFQLs ، راجع المنشور الذي كتبه Herzog et al.25. انظر بعض الأمثلة على ملفات MFQL في https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library وانظر المناقشة. يتم توفير جميع MFQLs المستخدمة لمعالجة البيانات في المواد التكميلية.
  4. حدد كمية الأنواع المحددة على مستوى MS بقسمة شدة كتلة السلائف لميزة الدهون على شدة المعيار الداخلي المسمى ثم ضرب حاصل القسمة في تركيز المعيار الداخلي الموسوم. تطبيع تركيز الدهون النهائي لكل كمية من البروتين الكلي المقاس بواسطة فحص برادفورد.

8. إجراء فحص مراقبة الجودة

ملاحظة: يعد إجراء فحص الجودة خطوة أساسية للتحقق من قابلية التكرار الفني للطريقة. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم تحليل البلازما المجمعة التجارية لتحديد المستويات الداخلية للدهون المختلفة على مدى 5 أيام في 15 حصصا متطابقة لكل دفعة (إجمالي خمس دفعات). لاحظ أنه في هذه الحالة ، تم إنشاء خط أنابيب تقييم البيانات كتطبيق ويب Shiny باستخدام بيئة البرامج الإحصائية R.

  1. حدد نطاق القبول المرجعي على أنه متوسط القيمة المحسوبة لجميع الدفعات الخمس ±3 انحرافات معيارية.
  2. تطبيق قواعد قبول "النجاح" لكل دفعة تحليلية: يجب أن تمر 90٪ من الأهداف المرجعية ، مع الأخذ في الاعتبار أن مركبا مرجعيا واحدا يمثل فئة دهنية واحدة. على سبيل المثال ، إذا تم تضمين 15 هدفا مرجعيا في التحقق من مراقبة الجودة ، فتأكد من اجتياز 13 هدفا لقبول الدفعة.
    ملاحظة: بمعنى آخر ، يجب أن تمر 68٪ من عينات مراقبة الجودة لكل مركب مرجعي حتى يتم قبول البيانات الخاصة بفئة الدهون هذه.
  3. إذا كانت دفعة الدراسة لا تفي بمعايير القبول لفحص مراقبة الجودة ، كرر الإجراء.

9. تقدير كميات الأحماض الدهنية المترافقة (النسبية)

  1. لكل فئة دهون ، قم بتقدير كميات الأحماض الدهنية المترافقة بناء على شدتها MS2.
    ملاحظة: نظرا لاختلافات التجزئة والتأين ، كانت القيم المشتقة مخصصة فقط لمقارنات الوفرة النسبية عبر مجموعات العينات بدلا من ، على سبيل المثال ، لتقدير المساهمة النسبية لحمض دهني معين في إجمالي تجمع الأحماض الدهنية المترافقة لفئة الدهون.
  2. تطبيع شدة MS2 لشظايا الأحماض الدهنية بمتوسط كثافة شظايا الأحماض الدهنية للمعيار الداخلي المقابل. بناء على تركيز المعيار الداخلي ووزن الأنسجة المقاس ، اشتق "تركيزا طبيعيا" للأحماض الدهنية المترافقة. لخص هذه القيم لكل فئة ليبيدات لتقدير الكمية الإجمالية لكل حمض دهني مقترن لكل عينة.

10. التحليل الإحصائي

  1. إجراء التحليل الإحصائي. قم بملاءمة نموذج خطي لكل حالة ومجموعة التحكم المقابلة ، واحسب قيم p من إحصائية t للبيانات المحولة log2. استخدم طريقة معدل الاكتشاف الخاطئ Benjamini-Hochberg لتصحيح تأثيرات الاختبار المتعددة.
    ملاحظة: تعتبر الدهون ذات قيم p المعدلة < 0.05 وفيرة بشكل تفاضلي. هنا ، تم إجراء التحليل الإحصائي في البيئة الإحصائية R26.

النتائج

هنا ، كنتائج تمثيلية ، نقدم بيانات توضح كيف يمكن استخدام دهون البندقية لدراسة آثار CS على رئتي الفئران. تم تطبيق بروتوكول تحليل الدهون في البندقية بنجاح لدراسة في الجسم الحي للتحليل المقارن لمجموعتين من العينات: أنسجة الرئة التي تم تشريحها من تسع إناث من الفئران Apoe- / - المعرضة ل CS (مجموعة 3R4F ؛ التحكم الإيجابي) وعدد متساو من الفئران التي تم الاحتفاظ بها تحت ظروف الهواء النقي (مجموعة وهمية) كسيطرة سلبية تم جمعها في 3 أشهر ، 4 أشهر ، و 6 أشهر نقاط وقت التعرض. تم الاحتفاظ بالحيوانات تحت الهواء النقي المصفى والمكيف عند 22 درجة مئوية ± درجة حرارة 2 درجة مئوية و 55٪ ± 15٪ رطوبة وتغذت على نظام غذائي بالحبيبات المشععة بأشعة جاما. تم الحفاظ على نظام الضوء في 12 ساعة في اليوم. تم إيواء ما يصل إلى ثمانية فئران لكل قفص. تم شراء السجائر المرجعية 3R4F لمعالجة التعرض من جامعة كنتاكي لتوليد الهباء الجوي 3R4F CS (600 ميكروغرام من إجمالي الجسيمات TPM / L الهباء الجوي) لتركيز التعرض المستهدف ما يعادل 28 ميكروغرام من النيكوتين / لتر.CS تم إنتاج الدخان من سجائر 3R4F باستخدام آلات تدخين دوارة ذات 30 منفذا وفقا ل Phillips et al.27 . استنادا إلى بروتوكول التدخين المكثف في وزارة الصحة الكندية ، تم تطبيق 55 مل من حجم النفخة ، ونفخة واحدة لكل 30 ثانية ، وانسداد فتحات التهوية بنسبة 100٪ على سجائر 3R4F لتوفير التعرض الكافي. تم الإبلاغ عن جميع التفاصيل الإضافية حول تصميم الدراسة سابقا27,28.

بشكل عام ، تم تحديد ~ 400 نوع من الدهون الجزيئية من فئات الدهون ال 14 الأكثر وفرة وقياسها كميا (الشكل 3). كان إجمالي تركيز الدهون الطبيعي لكل فئة مرتفعا بشكل طفيف لفئات الدهون PE و PEO و PC و PCO و PI و PG ، ولوحظ بعض التنظيم الناقص للدهون SM و LPE و PA (الشكل 3A) ، بينما لا يمكن رؤية أي فرق ل TAGs و PS. ومن المثير للاهتمام ، تم الإبلاغ عن مستويات مرتفعة من دهون البلازمالوجين PCO و PEO في مجموعة CS في الخلايا الالتهابية29 . واحدة من وظائف داخل الخلايا من الدهون البلازمالوجين هو نشاط مضاد للأكسدة. تحت التعرض للأكسجين التفاعلي (ROS) وأنواع النيتروجين (RNS) ، تم الإبلاغ عن الأكسدة الانتقائية للبلازمالوجينات مقارنة ب diacyl phospholipids30. رابطة إنيل الأثير في التركيب الكيميائي للبلازمالوجينات حساسة للهجوم الجذري على الإجهاد التأكسدي31. المنتجات الرئيسية للهجوم الجذري هي أحماض إيكوساتيتراينويك الهيدروكسيلية ، 2-أحادي الجلسرين الفوسفوليبيدات ، بنتاديكانول ، أحماض الفورميك ، α-هيدروكسي ألدهيدات بأطوال سلسلة مختلفة ، 1-فورميل-2-أراكيدونويل غليسيروفوسفوليبيد ، وليسوفوسفوليبيدات.

تظهر هذه النتائج أنه من بين السمات الجزيئية القائمة على الصيغة الجزيئية الكلية ، تأثر 100-120 مركبا بشكل كبير بالتعرض ل CS (الشكل 3D). سمح الالتفاف التفصيلي لمعلومات تجزئة MS2 وتطبيع شدة إشارة الشظايا بالتعريف التقريبي للكمية الإجمالية لكل حمض دهني مقترن (FA) ممثل في كل فئة دهنية (الشكل 3E) ومقارنة هذه البيانات بين المجموعات المكشوفة والمجموعة الضابطة. لوحظ انخفاض واضح في كل من FAs المشبعة بالكامل وتلك التي تحتوي على عدد قليل من عدم التشبع ، معظمها في سياق الدهون الليزو. في المقابل ، كانت الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFA) في تكوين فئات الفوسفوليبيد PC و PE و PG مرتفعة في مجموعة CS لجميع النقاط الزمنية. تم الكشف عن الحالات القصوى من PC و PG المترافقة مع eicosapentanoic (EPA) وحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA) حصريا في مجموعة التعرض 3R4F CS (الشكل 3E ، اللون الأحمر).

figure-results-3541
الشكل 1: تخطيط اللوحة لتوزيع العينات في مقايسة برادفورد. توضع العينات الفارغة والقياسية في ثلاث نسخ في الأعمدة 1-3 ؛ يتم وضع عينات غير معروفة في نسختين في الأعمدة 4-11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4051
الشكل 2: تخطيط لوحة لوحة المعايرة الدقيقة ذات 96 بئرا لتحليل مطياف كتلة البندقية. يتم تعيين توزيع العينات الفارغة والقياسية وغير المعروفة ومراقبة الجودة للاقتناء في وضع التأين الإيجابي على الجانب الأيسر من اللوحة (الأعمدة 1-6) ؛ يتم وضع جميع العينات لوضع التأين السلبي على اليمين (الأعمدة 7-12). الاختصارات: pos = إيجابي ؛ مراقبة الجودة = مراقبة الجودة ؛ neg = سلبي ؛ TB = إجمالي فارغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4778
الشكل 3: تحليل شحوم البندقية لرئتي الفأر المعرضتين لدخان السجائر. تعرضت فئران Apoe− / - ل CS من السيجارة المرجعية 3R4F أو الهواء النقي (الوهمية). أ: تركيزات فئة الليبيدات وعدد أنواع الليبيدات لكل طبقة. لكل فئة، يعطى عدد أنواع الليبيدات الكمية بين قوسين. فترات ثقة متوسطة و 95٪ لكل فئة دهون ، بشكل منفصل لكل نوع من أنواع التعرض (مجمعة عبر ثلاث نقاط زمنية). (ب) مخططات البركان التي توضح حجم التأثير (تغير أضعاف log2) والأهمية (-log10 قيمة p المعدلة ب FDR) لأنواع الدهون الكمية لمقارنة 3R4F CS مقابل الوهمية في النقاط الزمنية الثلاث. يتم تمييز الدهون المرتفعة بشكل ملحوظ باللون الأصفر. يتم تمييز الدهون المنخفضة بشكل ملحوظ باللون السماوي (قيمة p المعدلة بنسبة FDR < 0.05). ج: الوفرة التفاضلية لأنواع الليبيدات البالغ عددها 25 نوعا مع أكبر تغيرات في متوسط الطيات المطلقة. تغييرات أضعاف Log2 لمقارنة 3R4F CS مقابل الوهمية مرمزة بالألوان ، ويشار إلى الأهمية الإحصائية: *: قيمة p المعدلة من قبل FDR < 0.01 ؛ X: قيمة p المعدلة من قبل FDR < 0.05. (د) قطع المقارنة. معاملات الارتباط لمقارنات تغير الطيات مرمزة بالألوان ، ويشار إلى عدد الدهون الوفيرة التفاضلية المشتركة (إجمالي الأرقام في الهوامش). تظهر المخططات الدائرية النسبة المئوية للدهون الوفيرة التفاضلية المشتركة بنفس اتجاه التغيير (علامة FC). تشير العلامة النجمية إلى تداخل كبير في الدهون الوفيرة التفاضلية. ه: الوفرة التفاضلية للاتحادات الفاسدة المترافقة لكل فئة من فئات الدهون. خريطة الحرارة كما في اللوحة C للأحماض الدهنية المترافقة مع اختلافات وفرة كبيرة بين 3R4F والتعرض الوهمي في جميع النقاط الزمنية الثلاث (قيمة p المعدلة ب FDR < 0.05). تم تقدير كمية كل حمض دهني لكل فئة دهنية بناء على شدة MS2 لشظايا الأحماض الدهنية. الاختصارات: CS = دخان السجائر. FDR = معدل الاكتشاف الخاطئ ؛ FC = أضعاف التغيير ؛ FA = الأحماض الدهنية. PC = فوسفاتيديل كولين. PS = فوسفاتيديل سيرين. TAG = ثلاثي الجلسرين ؛ SM = سفينغوميلين. PEO = بلازمالوجين فوسفاتيديل إيثانولامين. PE = فوسفاتيديل إيثانولامين. PG = فوسفاتيديل الجلسرين. PI = فوسفاتيديلينوسيتول. DAG = دياسيل الجلسرين ؛ SE = استرات ستيرول / كوليستيريل ؛ PCO = بلازمالوجين فوسفاتيديل كولين. LPC = ليسو فوسفاتيديل كولين. LPE = ليسو فوسفاتيديل إيثانولامين. PA = حمض الفوسفاتيديك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التركيز النهائي ل BSA (ملغم / مل)محلول BSA عند 2 ملغم / مل (ميكرولتر)عازلة بيكربونات الأمونيوم (μL)
15050
0.7537.562.5
0.52575
0.2512.587.5
0.12512.5187.5
0.062550 من محلول 0.125 ملغم/مل50
00100

الجدول 1: مخطط التخفيف للمعيار الداخلي BSA لمنحنى المعايرة لمقايسة برادفورد. اختصار: BSA = ألبومين مصل الأبقار.

معلومات تكميلية: ملفات MFQL المستخدمة لتحديد الدهون LipidXplorer. تتكون الحزمة .zip من ملفات MFQL الفردية المطلوبة ، كل منها مسمى باتباع هذا النمط: اختصار فئة < الدهون>__<وضع التأين>_MS2.mfql (على سبيل المثال ، PE_neg_MS2.mfql). تتضمن أسماء الملفات للتعريف القياسي الداخلي المسمى علامة D7 (D9) في <اختصار الدهون> (على سبيل المثال ، PED7_neg_MS2.mfql). يتم استخدام هذه الملفات MFQL للتحقق من كمية الديوتيريوم في المعيار الداخلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

على الرغم من أن التقدم في مرض التصلب العصبي المتعدد قد أسفر عن مجموعة متنوعة من الطرق لمراقبة العديد من أنواع الدهون بدقة ، إلا أن التنميط الدهني السابق لأنسجة الثدييات المختلفة لم يظهر نتائج متسقة ، وبالتالي ، لا تزال الوظائف الخاصة بالأنسجة للدهون غير واضحة. بالمقارنة مع التحليل الوظيفي للبروتين ، حيث تتوفر طرق أكثر قوة لضرب التعبير عن مركبات معينة ، لا يمكن إيقاف تشغيل غالبية الدهون بشكل انتقائي أو الإفراط في التعبير عنها في الأنسجة ، مما يجعل التقييم الوظيفي للدهون صعبا. قد يوفر التنميط المتقدم لتركيزات الدهون في الأنسجة نهجا بديلا لتحديد الارتباطات بين الدهون المنتشرة والأمراض البشرية.

عند تقييم طرق الدهون الشاملة القادرة على تغطية ملف الدهون الداخلي لأي نسيج فأر نوعيا وكميا، أعطينا الأفضلية لطريقة الدهون في البندقية. بشكل عام ، هناك نوعان متعاكسان من تحليل العينات: إما فحص غير مستهدف تماما للدهون باستخدام الفصل القائم على الكروماتوغرافيا السائلة (LC) مع مزيد من الكشف الطيفي الكتلي للكشف عن التعقيد الكلي للدهون في العينة ، أو الأساليب المستهدفة ، والتي تسمح في الغالب بقياس دقيق للغاية للدهون المحددة ذات الأهمية. في المقابل ، فإن الميزة القوية لسير عمل الدهون المقدمة هي التغطية الشاملة السريعة لمئات الدهون الداخلية من فئات الدهون المحددة مسبقا ، والتي لا يزال من الممكن إجراؤها بطريقة شبه كمية قوية.

تعتمد كفاءات التأين لفئات الدهون المختلفة على التركيب ويمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على ظروف التأين التجريبية المختلفة. على عكس طرق الفصل القائمة على LC ، يقلل تحليل البندقية من هذه الاختلافات بسبب التسريب المتزامن المباشر لمستخلص الدهون بالكامل في ظل نفس ظروف التأين في أداة MS. يسمح استخدام نظائر الدهون الموسومة نظائريا أو المعايير غير الداخلية المماثلة هيكليا بالقياس شبه الكمي لجميع فئات الدهون. توفر دهون البندقية تباينا منخفضا بين وأثناء التشغيل أثناء تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. نتيجة لذلك ، تنتج هذه الطريقة معاملات تباين أقل21 من الطرق غير المستهدفة القائمة على الكروماتوغرافيا السائلة ، والتي تتطلب معايير متعددة للقياس الكمي الكافي. الأهم من ذلك ، على الرغم من عدم استخدام منحنى معايرة خارجي في الطريقة الحالية ، إلا أن الطريقة لا تزال تعتبر كميةبالكامل 32.

مستوى واحد من المعيار الداخلي المسمى (أو المعيار غير المسمى الذي لم يتم التعبير عنه داخليا) لكل فئة دهون يكفي لتحديد كمية معظم الدهون. أبلغ عدد قليل فقط من المنشورات عن التحقق من صحة الطريقة الجزئية لطريقة الدهون في البندقية. على سبيل المثال ، في Gryzbek et al.17 و Surma et al.21 ، تم إعداد منحنيات المعايرة المعكوسة باستخدام معايير داخلية وكمية ثابتة من مصفوفة العينة. تم تقييم الخطية من خلال الانحدار الخطي لكميات الدهون المحولة لوغاريتمية وكثافتها وتم الإبلاغ عنها على أنها R2 والمنحدر ، على التوالي. تم تحديد حد الكشف (LOD) وحد القياس الكمي (LOQ) من خلال الانحدار الخطي المرجح على أساس نسبة الإشارة إلى الضوضاء البالغة 3 ل LOD و 10 ل LOQ. بالنسبة لمعظم فئات الدهون ، تم تعريف LOQ بين 2-9.8 pmol للأنسجة الدهنية و 0.05-5μM في البلازما. في كلتا الحالتين ، تم استخدام معايير داخلية مفردة غير داخلية لكل فئة لاشتقاق تقديرات لجميع الدهون في الفئة. ومع ذلك ، في هذا العمل ، لا نقدم LOD / LOQ بسبب العديد من المخاوف: المصفوفة الداخلية ليست خالية من المركبات ، والمصفوفة البديلة للأنسجة غير متوفرة - مع هذا ، فإن ارتفاع كميات صغيرة معروفة من المعايير غير ممكن. نحن لا ننفذ نهج القياس الكمي المستهدف الكلاسيكي باستخدام سلسلة منحنى معايرة لمركب معين تم تطبيعه بواسطة معياره المطابق المسمى نظائريا بسبب عدم وجود معايير نقية والتوافر المحدود للغاية للدهون الموسومة نظائريا. تقوم كاشفات Orbitrap تلقائيا بتحويل الإشارة العابرة عن طريق تطبيق تحويل فورييه ، ويتم استبدال بعض الإشارات بالفعل - ونتيجة لذلك ، سيكون نطاق التركيز المنخفض خطيا فقط وصولا إلى بعض الإشارات الدنيا ، والتي لن يكون الجزيء قابلا للكشف عنها بعد الآن. تعتمد قيم إشارة إلى ضوضاء برنامج Xcalibur على نسبة m / z للجزيء ؛ نتيجة لذلك ، سيكون لمركبات كل فئة دهنية ، تحتوي على مجموعات مختلفة من الأحماض الدهنية ، قيم ضوضاء مختلفة. علاوة على ذلك ، ترتبط قيم LOQ / LOQ ارتباطا وثيقا بنوع المصفوفة ، وعندما يتم إجراء القياس الكمي للدهون في أنسجة القوارض المختلفة ، يجب أن ينعكس ذلك من خلال تقييم LOQs لكل نوع من الأنسجة على حدة.

في الواقع ، توفر الطريقة نطاقا كميا ديناميكيا خطيا عاليا يصل إلى أربعة أوامر من الحجم33 وحساسية جيدة جدا لتغطية أهم الدهون الهيكلية الداخلية ، والتي يمكن زيادتها بشكل أكبر من خلال التحسينات التقنية في اكتساب MS32. كانت معاملات الاختلاف في متوسط تركيزات الدهون في الغالب أقل من 15٪ ، مما يعني أن دهون البندقية تتوافق مع متطلبات إدارة الغذاء والدواء (FDA) كطريقة يجب مراعاتها للممارسة المختبرية الجيدة (GLP) والممارسة السريرية الجيدة (GCLP)دراسات 34.

ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه بسبب قطبية مختلفة ، تصبح بعض فئات الدهون أكثر تأثرا بمساهمة FAs مترافقة محددة. وهذا يؤدي إلى تشويه في استجابة الشدة في المخاليط المتساوية المولية التي تحتوي على مجموعة واسعة من FAs المترافقة ، مما يؤدي إلى تحيز القياس الكمي ، كما أوضح Koivusalo et al.35 لفئات الفوسفوليبيد. وتجدر الإشارة إلى أن هؤلاء المؤلفين قدموا بيانات لمجموعة واسعة من FAs ، من 24-48 طول السلسلة ، والتي من المحتمل ألا تعكس الوضع في عينة بيولوجية حقيقية. كانت الاستجابة للأنواع المتعددة غير المشبعة أعلى بنسبة 40٪ من الأنواع المشبعة بالكامل ، ولكن لوحظ هذا التأثير فقط للتركيزات الأعلى. عندما تم تخفيف الخليط تدريجيا ، تضاءل تأثير عدم التشبع تدريجيا واختفى تقريبا عند 0.1 بمول / ميكرولتر لكل نوع. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء جميع القياسات على أجهزة مصيدة الأيونات وأجهزة رباعية الأقطاب الثلاثية وليس على معدات Q-Exactive.

ميزة أخرى لسير العمل المقدم هي مرونته الفنية ، والتي تسمح بالتكيف مع متطلبات المشروع المحددة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام أي بروتوكول لاستخراج الدهون - مثل طرق Bligh and Dyer36 المعدلة أو ميثيل ثلاثي بوتيلإيثر 37 أو بيوتانولميثانول 38 - لإعداد مستخلص دهني كلي قبل تحليل MS. القيد الرئيسي لاستخراج الكلوروفورم والميثانول هو أن المرحلة السفلى تحتوي على جزء الدهون ، مما يعقد العمل الروتيني وخاصة الأتمتة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب النظر في سمية الكلوروفورم. يستخدم استخراج الأثير ثلاثي بوتيل على نطاق واسع لتحليل الدهون لعينات البلازما37 ، وقد تم اقتراح نسخة آلية21. في هذه الحالة ، اخترنا طريقة BUME لأنها توفر عمليات استرداد أفضل لفئات الدهون PG و PI و PA و PS38 ، واستهلاك أقل للمذيبات ، وإمكانية الأتمتة39 ، في حين أن التركيزات الإجمالية المحددة كميا لعينات الأنسجة المستخرجة من جميع الطرق الثلاث كانت قابلة للمقارنة. بالإضافة إلى ذلك ، بينما تم إجراء استخراج العينة يدويا في العمل الحالي ، من الممكن أيضا الحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار من مجموعات العينات الكبيرة عن طريق التحضير الآلي للعينات واستخراج الدهون بتنسيق 96 بئرا40,41. هذا يسمح للمرء بتنفيذ تحليل الدهون في الدراسات السريرية والسمية واسعة النطاق.

في العمل الحالي ، أجرينا اكتساب MS للأوضاع الإيجابية والسلبية بشكل منفصل دون تبديل القطبية كما هو موضح من قبل Schuhmann et al.42. يكون استقرار إشارة النانو أفضل في الوضع السلبي لمحلول أقل تركيزا قليلا منه في الوضع الإيجابي. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير إجراء يمكن تتبعه بالكامل باستخدام برنامج محول من ملفات .raw إلى mzML ، والذي يوفر القيم التي سيتم تحديدها في برنامج LipidXplorer - مع هذا ، لا يلزم إجراء حسابات منحدر الدقة اليدوية. قمنا أيضا بتطبيق بدائل مختلفة لإعداد الضوضاء لأنه في الوضع الإيجابي ، تكون مستويات ضوضاء الأطياف أعلى منها في الوضع السلبي. تم تحسين جميع الخطوات لإجراء تحليلات روتينية عالية الإنتاجية يمكن تتبعها.

لتحديد الهوية ، يمكن لتحليل الدهون في البندقية استغلال السلوك الفريد لفئات الدهون المختلفة ، والتي تشكل مواد مضافة فريدة في أوضاع قطبية مختلفة. في هذه الطريقة ، يمكن فصل أنواع PC و PE التي لها نفس الكتلة الجزيئية التي تتداخل في وضع التأين الإيجابي تماما في وضع التأين السلبي ، حيث يشكل PC أسيتات أو فورمات ، ويتأين PE في شكل منزوع البروتون. علاوة على ذلك ، فإن الالتفاف الهيكلي (الجزئي) ممكن للطريقة التي لا تستخدم فقط الصيغة الجزيئية ولكن أيضا بنية الأحماض الدهنية السائبة. على سبيل المثال ، يعمل تحديد FA على مستوى إجمالي الكربون وعدد إجمالي عدم التشبع لجميع الدهون الفوسفاتية و DAGs و TAGs و lyso-phospholipids. يمكن إجراء القياس الكمي من أسفل إلى أعلى لكل شكل إيزوميري جزئيا لبعض فئات الفوسفوليبيد43 ولكنه أكثر تعقيدا بالنسبة ل DAGs و TAGs بسبب استجابة الإشارة غير المتكافئة لمختلف FAs في أطياف MS2.

ومن المهم أيضا التأكيد على الحاجة إلى تنفيذ إجراءات مناسبة لمراقبة الجودة، تتماشى تماما مع المبادرات الأخيرة في هذا الميدان44. نظرا لأننا نرغب في ضمان إمكانية تتبع البيانات واستنساخها بشكل صحيح بين المختبر وداخله ، فقد تم اتخاذ عدد من الخطوات مثل التوزيع العشوائي المناسب للعينات لجميع خطوات التحليل ، والعمل مع الخلائط القياسية المعتمدة من المورد ، وإدراج عينات مراقبة الجودة ، وإجراءات التحقق من قبول الدفعات أو رفضها ، وإنشاء قاعدة بيانات داخلية لتتبع أداء مراقبة الجودة على المدى الطويل. كما تتسق مع هذه المبادرات الحاجة إلى طريقة موحدة لمعالجة استقرار العينة. بشكل عام ، لا تتأثر غالبية الليبيدات الهيكلية بأكسدة الليبيدات ، وهو أكثر صلة بالأوكسيليبينات والليبيدات المؤكسدة والأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة التي تكون بالتالي أكثر حساسية لظروف التخزين والمناولة. ومع ذلك ، لا يزال التقييم الصحيح لاستقرار العينة مهمة صعبة من الناحية الفنية.

ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول له قيود عندما يتعلق الأمر بتحديد المستويات دون الجزيئية للمركبات. بالنظر إلى أنه لا يوجد فصل للمستخلص الكلي ، يتم دمج جميع أشكال متساوية من الدهون التي لها نفس الكتلة الجزيئية ولكن تركيبات الأحماض الدهنية المختلفة في تحليل MS. بالنسبة لمعظم الفئات ، من الممكن تحقيق فك جزئي للهيكل باستخدام نسب تجزئة شظايا الأحماض الدهنية المتبقية في MS2. ومع ذلك ، لا يزال القياس الكمي المستقل لكل شكل متساوي الشكل مهمة صعبة بشكل خاص بسبب الاختلافات الكبيرة في سلوكيات التجزئة لمختلف الأشكال المتساوية وحقيقة أن المعايير الكيميائية النقية غير متوفرة في مجموعة كبيرة بما يكفي لتحديد قيم التعويض. هناك قيد آخر هو أن عملية ESI تولد حتما قطعا أثرية ، مما يؤدي إلى توليد قمم اصطناعية لبعض الدهون مثل DAGs و Pas و FAs ، مما قد يؤدي إلى تقدير كمي خاطئ.

بعد ذلك ، نلخص الأجزاء الأكثر أهمية في البروتوكول بناء على تجربتنا. الأول يتعلق بحقيقة أن كل نوع من أنواع أنسجة الفئران له ملف تعريف دهني فريد من حيث كل من كمية الدهون ونسب الطبقة. مع هذا ، يجب تحديد كميات البدء من الأنسجة بناء على محتوى البروتين الكلي قبل الاستخراج بعناية حتى لا تشبع إشارة MS وعدم ترك نطاق القياس الكمي الديناميكي بسبب تراكم الدهون بتركيزات عالية33 أو - في الطرف المعاكس - لتوفير إشارة MS كافية لتغطية مركبات الدهون الرئيسية لكل فئة دهنية.

الجانب الثاني الحاسم هو ضمان المحاذاة الصحيحة لموضع منفذ رقاقة مصدر النانو بالتسريب المباشر مع شعرية النقل لمطياف الكتلة. بالنظر إلى أن المعايرة الكاملة لمطياف الكتلة في كلا الوضعين يتم إجراؤها أسبوعيا ، فإن التبديل بين مصدر المعايرة وإعداد رقاقة مصدر النانو يمكن أن يكون سبب التباين الكبير في شدة الإشارة بسبب عدم المحاذاة أثناء التثبيت.

جزء آخر مهم من البروتوكول هو التعامل الدقيق مع مزيج المعايير الداخلية. نظرا لأن هذا الخليط يحتوي على كمية كبيرة من ثنائي كلورو ميثان ، بمجرد فتحه ، يجب استهلاكه بسرعة لتجنب التخزين الطويل والاستخدامات المتعددة التي تؤدي إلى التبخر وتغيير التركيز الاصطناعي. علاوة على ذلك ، فإن المعالجة المتسقة للخليط القياسي بعد الإزالة من التخزين -20 درجة مئوية أمر مهم ، لأن الاختلافات في درجات الحرارة يمكن أن تؤدي إلى عدم تناسق الحجم أثناء السحب باستخدام ماصات وسادة الهواء. يتمثل أحد الخيارات في استبدال ثنائي كلورو الميثان في المخزن المؤقت القياسي لإعادة التعليق بالميثانول النقي ، مما قد يحسن راحة المناولة ولكنه قد يؤثر سلبا على قابلية ذوبان بعض فئات الدهون ، وبالتالي يقلل من دقة القياس الكمي لفئات الدهون هذه.

الجزء الأخير الحاسم هو معالجة البيانات. يجمع سير عمل معالجة البيانات بين تحويل برنامج Peak by Peak من تنسيق .raw إلى تنسيق .mzML ، وتطبيق متوسط فحص MS2 وترشيح الضوضاء MS1 و MS2 ، بالإضافة إلى انتقاء الذروة وضغط البيانات. كبديل ، يمكن أيضا استخدام برنامج Proteowizard لتحويل البيانات ، ولكن في هذه الحالة ، يجب تحديد العديد من الإعدادات في LipidXplorer يدويا. يتركز كل تعقيد علم الدهون في البندقية بشكل خاص على خطوة إزالة الالتفاف لأطياف الحقن المباشر MS1 و MS2. يستورد برنامج LipidXplorer مفتوح المصدر الأطياف المحولة من تنسيق ملف mzML بناء على دقة الكتلة ودقة الكتلة وميل تغييرها مع زيادة m / z. يدمج البرنامج العديد من أطياف MS و MS / MS الفردية المكتسبة ضمن عملية التحليل. بعد ذلك ، يقوم بمحاذاة القمم الفردية داخل عمليات تشغيل عينات مختلفة ، وفي كل مجموعة من القمم المحاذية ، يستبدل كتلها بمتوسط كتلتها المرجح بالشدة الفردية ، بينما تظل وفرتها في كل ملف بيانات كما هي. يتم تخزين الكتل التمثيلية لمجموعات الذروة المحاذاة وكثافة الذروة الفردية في قاعدة بيانات المسح الرئيسي. تحتوي قاعدة بيانات المسح الرئيسي على جميع أطياف MS1 و MS2 التي تم إنشاؤها لجميع العينات في الدفعة ويمكن فك تجميعها إلى تعريفات الدهون عن طريق الاستعلامات المكتوبة بلغة استعلام التجزئة الجزيئية (MFQL).

بشكل عام ، تغطي الطريقة تحديد دهون DAG و TAG و SE بناء على الوضع الإيجابي ودهون PC و PE و PS و PI و PA و PG و SM و LPC و LPE بناء على اكتساب الوضع السلبي. أثناء تحديد الدهون ، يتم إجراء تصحيح النظائر ل MS1 و MS2 ، ويتم الإبلاغ عن الشدة المعدلة في ملف إخراج .xlsx. بدلا من ذلك ، تتوفر العديد من البرامج الأخرى لمعالجة بيانات البندقية ، مثل ALEX45 و LipidHunter46.

يتم تخزين الأحماض الدهنية - مكونات الأغشية النووية والخلوية الرئيسية - في شكل فوسفوليبيدات لمزيد من التحويل إلى جزيئات نشطة بيولوجيا. يمكن تحويلها بواسطة إنزيمات أسيلترانسفيراز الليزوفوسفوليبيد إلى ليسوفوسفوليبيدات من خلال مسار الأراضي47. من المعروف أن إنزيم LPCAT3 ، على سبيل المثال ، يظهر خصوصية عالية لدمج AA في وسيطة ليسوفوسفاتيديل كولين وليسوفوسفاتيديل سيرين. تم الإبلاغ عن التعبير العالي نسبيا لهذه الإنزيمات داخل الخلايا الالتهابية ، مثل الضامة السنخية والخلايا الظهارية القصبية47 ، مما أدى إلى إطلاق نسب نسبية أكبر من الدهون الفوسفاتية المحتوية على AA في تلك الخلايا. ومع ذلك ، بعد تحريرها من الدهون الفوسفاتية الغشائية بواسطة الفوسفوليباز A2 ، يتم تحفيز تحويل PUFAs إلى أنواع مختلفة من وسطاء الدهون بواسطة العديد من الإنزيمات48. علاوة على ذلك ، يمكن أن تصبح هذه PUFAs الركيزة لإنتاج البروستاجلاندين المؤيد للالتهابات والمضادة للالتهابات عن طريق عمل إنزيمات الأكسدة الحلقية (COX) -1 و COX-247. الفوسفوليبيدات هي أحد مصادر وسطاء الدهون التي يتم إطلاقها في مواقع معينة حيث يطلب من هؤلاء الوسطاء إظهار تأثيراتهم البيولوجية.

الرئة هي عضو معقد يضم أنواعا متعددة من الخلايا ، يلعب كل منها أدوارا متداخلة ومتخصصة في تسهيل نمو الرئة الطبيعي ووظيفته. تم إجراء عدد قليل فقط من الدراسات لعزل وتمييز أنواع مختلفة من الخلايا في الفأر أو الرئة البشرية (على سبيل المثال ، الخلايا السنخية من النوع 2)49,50 ؛ لم يتم تمييز أنواع خلايا الرئة الرئيسية الأخرى. أجريت دراسة أخرى مثيرة للاهتمام51 لعزل وإجراء تحليل الدهون للخلايا المناعية البطانية والظهارية والوسيطة والمختلطة في رئة الفأر. لوحظ أن تركيز PUFAs المدمجة في PCO و PG تم إثراؤه في الخلايا المناعية. بالنظر إلى حقيقة أن CS يحفز زيادة في الخلايا المناعية داخل الرئة (4-5 أضعاف) ، كما تم تقييمه بواسطة غسل القصبات الهوائية (BAL) 52 ، يمكن تفسير التغيرات الكلية في الدهون التي لوحظت في هذه الدراسة من خلال الزيادة التراكمية في تجنيد الخلايا المناعية في رئة الفأر.

في الختام ، يمكن أن يعكس التشويه الملحوظ للأحماض الدهنية الأحادية غير المشبعة و PUFAs المدمجة في الدهون الفوسفاتية زيادة بعض FAs داخل الخلية و / أو تشكل موردا داخل الخلايا من سلائف الأوكسيليبين التي يتم إنتاجها بشكل مفرط تحت الإجهاد التأكسدي والظروف الالتهابية. ومع ذلك ، فإن البيانات الإضافية حول EPA و DHA و oxilipins الأخرى ضرورية لتوضيح هذه النقطة وهي خارج نطاق تطبيق الطريقة الحالية.

Disclosures

جميع المؤلفين موظفون في شركة فيليب موريس إنترناشونال. فيليب موريس إنترناشيونال هي المصدر الوحيد لتمويل وراعي هذا المشروع.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا فريق الدراسة ويقدروا بشكل خاص المساعدة الفنية والدعم المقدم من فرق البحث الحيوي والهباء الجوي في PMI R&D ، مختبرات فيليب موريس الدولية للأبحاث Pte. المحدودة، سنغافورة، وشركة فيليب موريس موريس برودكتس إس إيه، نوشاتيل، سويسرا. يشكر المؤلفون سام أنصاري على إدارته للبنوك الحيوية ويقرون بدعم Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy لتحرير مسودة المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1, 5, and 2 mL self-lock tubesEppendorf30120086, 30120094
3 mm stainless still beadsQiagen69997
4.1 µm nozzle chipAdvionHD-D-384
Acetic acidSigma Aldrich45754-100ML-F
Ammonium acetateHoneywell14267-25G
Ammonium bicarbonateSigma Aldrich09830-500G
Bovine serum albumin standard, 2 mg/mLThermo Scientific 23209
ButanolHoneywell33065-2.5L
ChloroformSigma Aldrich650498-1L
DichloromethaneHoneywell34856-1L
Ethyl acetateHoneywell33211
Greiner CELLSTAR 96 well platesSigmaM9686
HeptaneSigma Aldrich34873-2.5L
IsopropanolFisher ScientificA461
MethanolFisher ScientificA456
Mouse pooled plasmaBioIvt
Mouse SPLASH standardAvanti Polar Lipids330710XInternal standard
Nunc 96-flat bottom well transparent platesVWR62409-068
Plastic spatulaSigmaZ560049-300EA
Quick Start Bradford 1x Dye reagentBioRad5000205
Serum diluentSigma AldrichD5197
Equipment/software
CryoPrep CP02 impactor instrumentCovaris   Magnetic hammer
Centrifuge 5427REppendorf.   Centrifuge
ChipSoft 8.3Advion Biosciences.   Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot
LipidXplorer 1.2.8.1N/A.   Software to identify lipids
Peak By PeakSpectroSwiss.   Software to convert .raw data from MS to .mzml format
ProteoWizardProteoWizard.   Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format
Q-Exactive MSThermo Fisher.   High resolution orbitrap mass spectrometer
Qiagen Tissue Lyser IIQiagen.   Tissue lyser
SpeedVac SPD140DDAThermo Fisher.   Vacuum concentrator
Tecan Infinite M nano plusTecan.   Plate reader
ThermoMixer CEppendorf.   Thermomixer
TriVersa NanomateAdvion Biosciences.   Direct infusion nano-source
Xcalibur 4.3Thermo Scientific.   Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS

References

  1. Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893 (2021).
  2. Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
  3. Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
  4. Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
  5. Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
  6. Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681 (2017).
  7. Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
  8. Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
  9. Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
  10. Talikka, M., et al., Lyubimov, A., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , (2016).
  11. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  12. Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
  13. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
  14. Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
  15. Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive 'shotgun' lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
  18. Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
  19. Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer's disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68 (2013).
  20. Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
  21. Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
  22. Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
  23. Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
  24. Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364 (2021).
  25. Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
  26. R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org/ (2018)
  27. Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
  28. Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
  29. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
  30. Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
  31. Nagan, N., Zoeller, R. A. Plasmalogens: Biosynthesis and functions. Progress in Lipid Research. 40 (3), 199-229 (2001).
  32. Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
  33. Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry - Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
  34. Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
  35. Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
  36. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  37. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  38. Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688 (2016).
  39. Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
  40. Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
  41. Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753 (2020).
  42. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  43. Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
  44. Lipidomics Standards Initiative Consortium. Lipidomics needs more standardization. Nature Metabolism. 1 (8), 745-747 (2019).
  45. Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736 (2013).
  46. Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
  47. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
  48. Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
  49. Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
  50. Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
  51. Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455 (2018).
  52. Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved