عزل الخلايا البدائية عن أجنة الدجاج اللاحم

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية من الأنسجة الدهنية في أجنة اللاحم. تتيح هذه الطريقة العزل مع غلة عالية ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي للخلايا الدهنية. قام تلطيخ الزيت الأحمر O وبقع الدهون / الحمض النووي بقياس القدرة الشحمية للخلايا المعزولة المستحثة بوسائط التمايز.

Abstract

الخلايا الشحمية الأولية هي نظام تجريبي قيم لفهم المسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي. توفر أجنة الدجاج الفرصة لعزل الخلايا الشهية من المرحلة المبكرة من التطور الدهني. يمكن استخدام هذه الخلية الأولية لتحديد العوامل التي تؤثر على انتشار الخلايا ما قبل الشحمية والتمايز الشحمي المنشأ ، مما يجعلها نموذجا قيما للدراسات المتعلقة بالسمنة في مرحلة الطفولة والسيطرة على ترسب الدهون الزائدة في الدواجن. النمو السريع للأنسجة الدهنية بعد الولادة يهدر الأعلاف بشكل فعال عن طريق تخصيصها بعيدا عن نمو العضلات في الدجاج اللاحم. لذلك ، قد توفر طرق فهم المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية أدلة لتنظيم هذا الميل وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة. تم تصميم هذه الدراسة لتطوير طريقة فعالة للعزل ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي المنشأ للخلايا الشهية المعزولة عن تطوير الأنسجة الدهنية لأجنة الدجاج اللاحم التجاري (نوع اللحوم). تم تحسين الإجراء لإنتاج خلايا ذات صلاحية عالية (~ 98٪) وزيادة القدرة على التمايز إلى خلايا دهنية ناضجة. تدعم هذه الطريقة البسيطة لعزل الخلايا المعقدة، وثقافتها، وتمايزها التحليلات الوظيفية لنمو الدهون وتطورها في الحياة المبكرة.

Introduction

السمنة هي تهديد صحي عالمي لكل من البالغين والأطفال. الأطفال الذين يعانون من زيادة الوزن أو السمنة هم أكثر عرضة بخمس مرات تقريبا للإصابة بالسمنة مثل البالغين ، مما يعرضهم لخطر متزايد بشكل كبير للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والعديد من الأمراض المصاحبة الأخرى. حوالي 13.4٪ من الأطفال الأمريكيين الذين تتراوح أعمارهم بين 2-5 يعانون من السمنة¹ ، مما يدل على أن الميل إلى تراكم الدهون الزائدة في الجسم يمكن أن يبدأ في وقت مبكر جدا من الحياة. لأسباب مختلفة جدا ، فإن تراكم الأنسجة الدهنية الزائدة هو مصدر قلق للدجاج اللاحم (نوع اللحوم). اللاحم الحديث فعال بشكل لا يصدق ولكن لا يزال يتراكم المزيد من الدهون مما هو ضروري من الناحية الفسيولوجية ^2,3. يبدأ هذا الاتجاه بعد فترة وجيزة من الفقس ويهدر الأعلاف بشكل فعال ، وهو أغلى مكون إنتاج ، عن طريق تخصيصه بعيدا عن نمو العضلات. لذلك ، بالنسبة لكل من الأطفال والدجاج اللاحم ، وإن كان ذلك لأسباب مختلفة للغاية ، هناك حاجة لفهم العوامل التي تؤثر على نمو الأنسجة الدهنية وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة.

تتشكل الخلايا الشحمية من الخلايا الدهنية ، وهي خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية تخضع للتمايز لتطوير خلايا دهنية ناضجة تخزن الدهون. وفقا لذلك ، فإن الخلايا البدائية في المختبر هي نموذج تجريبي قيم لدراسات السمنة. هذه الخلايا ، المعزولة عن الجزء الوعائي اللحمية من المستودعات الدهنية ، يمكن أن توفر فهما أساسيا للمسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي ^4,5. تعتبر أجنة الكتاكيت نموذجا تجريبيا مواتيا في الدراسات التنموية لأن زراعة البيض وفقا للجدول الزمني المطلوب يجعل التلاعب التجريبي أسهل ، لأنه يتيح الحصول على الأجنة دون تضحية الأم لمراقبة سلسلة من مراحل نمو الأجنة. علاوة على ذلك ، لا يلزم إجراء عمليات جراحية معقدة وفترات زمنية طويلة للحصول على الأجنة مقارنة بالنماذج الحيوانية الأكبر. لذلك ، يقدم جنين الفرخ فرصة للحصول على الخلايا الدهنية من المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية. تصبح الأنسجة الدهنية تحت الجلد مرئية في الفرخ حول اليوم الجنيني 12 (E12) كمستودع محدد بوضوح يقع حول الفخذ. يتم إثراء هذا المستودع في الخلايا الشحمية عالية التكاثر التي تخضع بنشاط للتمايز تحت إشارات تنموية لتشكيل الخلايا الشحمية الناضجة ^6,7. عملية التمايز الشحمي قابلة للمقارنة بين الدجاج والبشر. لذلك ، يمكن استخدام الخلايا البدائية المعزولة من أجنة الكتاكيت كنموذج مزدوج الغرض للدراسات ذات الصلة بالبشر والدواجن. ومع ذلك ، فإن غلة الخلايا الدهنية الأولية تنخفض مع الشيخوخة حيث تنمو الخلايا إلى الخلايا الشحمية الناضجة⁵.

يعمل البروتوكول الحالي على تحسين عزل الخلايا الدهنية عن الأنسجة الدهنية خلال المرحلة (E16-E18) التي يكون فيها التمايز الشحمي المنشأ وتضخم الخلايا الشحمية في ذروتهما في أجنة الفرخ اللاحم⁸. يمكن لهذا الإجراء تقييم آثار العوامل التي يتعرض لها الجنين النامي في البيضاوة ، مثل النظام الغذائي للدجاجة ، على تطور الخلايا الشحمية والإمكانات الشحمية خارج الجسم الحي. ويمكنه أيضا اختبار تأثير التلاعب المختلفة (على سبيل المثال ، نقص الأكسجة ، وإضافات المغذيات ، والناهضات الدوائية ، والخصوم) على تكوين الدهون أو مختلف 'omes' (على سبيل المثال ، transcriptome ، metabolome ، methylome) من أسلاف الخلايا الشحمية. كتمثيل للمرحلة المبكرة من تكوين الدهون ، تعد الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول نماذج قيمة للدراسات ذات الصلة بالدواجن والبشر.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة تينيسي. تم الحصول على بيض اللاحم التجاري المخصب حديثا (Cobb 500) من مفرخ محلي. تم احتضان البيض عند 38 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 60٪ حتى تشريحه في الأيام الجنينية 16-18 (E16-E18). تم جمع الأنسجة الدهنية من المستودع تحت الجلد (الفخذي).

1. الاستعداد للعزلة والثقافة

1. إعداد غطاء الثقافة والأدوات.
   1. قبل البدء في التشريح ، قم بإعداد منطقة عمل في غطاء محرك السيارة الرقائقي. تطهير منطقة العمل وجميع الأدوات عن طريق مسحة مع 70 ٪ من الإيثانول. تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام مواد معقمة.
      ملاحظة: قم دائما بمسح الحاويات والأدوات باستخدام 70٪ من الإيثانول قبل وضعها مرة أخرى في غطاء زراعة الخلية. يوصى بوضع جهاز تعقيم على الطاولة في غطاء المحرك بحيث يمكن تعقيم الأدوات بسهولة بين الأجنة.
      تنبيه: عند استخدام أداة تعقيم، قم بتبريد الأداة الساخنة بشكل صحيح لمنع إصابة الحروق وتلف الأنسجة. يوصى بوقت تبريد لا يقل عن 3 دقائق. مسحة مع 70٪ الإيثانول قبل الاستخدام.
   2. قم بتجميع الأدوات والأوعية التالية في غطاء المحرك: ملقط مستقيم (120 مم) ، ملاقط (110 مم) ، زوجان من الملقط المنحني (100 مم) ، زوجان من المقص المستقيم (140 مم) ، مقص جراحي منحني (115 مم) ، مصفاة الأنسجة (شبكة نايلون 250 ميكرومتر) ، مصفاة خلية (شبكة نايلون 40 ميكرومتر) ، أنابيب طرد مركزي مخروطية (15 مل و 50 مل) ، أطباق بتري (60 مم و 100 مم) ، كوب صغير (100 مل) ، رذاذ الإيثانول 70٪ وشاش معقم ، منشفة ورقية ، وممسحة على الطاولة (انظر جدول المواد).
2. قم بإعداد الحل الإنزيمي ووسائط التجميع والوسائط الثقافية باتباع الخطوات أدناه.
   ملاحظة: قم بإعداد المحاليل مسبقا وتخزينها على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. يجب وضع الوسائط على الجليد قبل جمع الأنسجة. يتم سرد جميع الكواشف المستخدمة في هذه الخطوة في جدول المواد.
   1. قم بإعداد الوسائط المستخدمة لكل من جمع الأنسجة الدهنية وإعداد محلول إنزيمي عن طريق استكمال DMEM / F12 (وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 2.50 mM من L-glutamine و 15 mM من مخزن HEPES المؤقت) مع 2.5 ميكروغرام / مل من Amphotericin B و 1x البنسلين / الستربتومايسين (P / S) ، 100 U / mL. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: تظل هذه الوسائط مستقرة لمدة 1 سنة عند تخزينها عند 4 درجات مئوية.
   2. تحضير محلول التعقيم عن طريق تخفيف بيتادين إلى 20٪ (v / v) في 1x PBS (محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات يحتوي على درجة حموضة 7.4 ، بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم أو الفينول الأحمر) مع 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B. يخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: الحل مستقر لمدة 2 سنوات عند تخزينه في 4 درجة مئوية.
   3. تحضير محلول إنزيمي عن طريق إذابة الكولاجيناز من النوع الأول (1 ملغم / مل) في DMEM / F12 مع 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B و 1x P / S (الخطوة 1.2.1). اصنع محلول كولاجيناز طازج وحافظ عليه على الثلج أثناء التشريح. قبل حوالي 10 دقائق من الاستخدام ، قم بتسخينه مسبقا عن طريق احتضان هذا المحلول عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لبدء نشاطه الإنزيمي.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى حوالي 1 مل من محلول الكولاجيناز (1 ملغ / مل) لكل 100 ملغ من الأنسجة الدهنية.
   4. قم بإعداد وسائط النمو المستخدمة للطلاء والانتشار عن طريق استكمال وسائط DMEM/F12 ب 1x P/S و 10٪ FBS. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: الحل مستقر لمدة 1 سنة عند تخزينه في 4 درجة مئوية.
   5. تحضير محلول الغسيل عن طريق استكمال 1x PBS مع 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B. ضبط الحل على الرقم الهيدروجيني المطلوب 7.4. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: الحل مستقر لمدة 2 سنوات عند تخزينه في 4 درجة مئوية.

2. جمع الأنسجة الدهنية والهضم

1. القتل الرحيم للجنين.
   1. في اليوم الجنيني 16 ، قم بإزالة البيض من الحاضنة. المصدر الرئيسي المحتمل للتلوث الميكروبي هو سطح البويضة. لذلك ، مسحة البيض بشاش معقم غارق في 70 ٪ من الإيثانول قبل تكسيرها. بعد المسح ، ضع البيضة عموديا مع النهاية المدببة لأسفل على كوب صغير (100 مل) مبطن بمناشف ورقية لتخفيف البيضة من الزجاج.
   2. باستخدام مقبض الملقط ، قم بكسر البيضة عن طريق النقر على الطرف الحاد للبيضة. قم بإزالة قشر البيض بعناية لإنشاء فتحة كبيرة بما يكفي لإزالة الجنين (الخطوة 2.1.3). تمزيق غشاء القشرة البيضاء بلطف لفضح الجنين (الشكل 1A). اخترق السلى بعناية باستخدام ملاقط معقمة (الشكل 1B).
      ملاحظة: الكيس الأمنيوسي هو غشاء شفاف مملوء بالسائل الأمنيوسي الذي يحيط بالجنين.
   3. قم بإزالة الجنين من البويضة عن طريق الإمساك بعنق الجنين برفق باستخدام ملقط مستقيم. اقطع كيس الصفار لفصله عن الجنين ، وانقل الجنين إلى طبق بتري 100 مم.
   4. قطع الرأس على الفور باستخدام المقص الجراحي والملقط.
2. إجراء جمع الأنسجة الدهنية.
   1. مسحة جسم الجنين مع 70٪ من الإيثانول وفرك سطح الجلد بلطف مع شاش معقم لإزالة الريش ، لأنها يمكن أن تتداخل مع الترشيح في خطوات لاحقة بعد الهضم. استخدم مساحات على الطاولة لمنع الجلد والريش من لمس الأنسجة المجمعة.
   2. قطع الجلد بين الساقين ومنطقة البطن للكشف عن زوج من مستودعات الدهون الفخذية.
   3. أمسك الجلد حول الساق باستخدام ملقط منحني بيد واحدة. قم بإزالة الدهون تحت الجلد الفخذية بلطف باليد الأخرى ، باستخدام ملقط منحني لسحب المستودع بلطف بعيدا عن الساق.
      ملاحظة: هناك القليل نسبيا من النسيج الضام الذي يلتصق بوسادة الدهون في الساق ، ويجب أن تكون وسادة الدهون بأكملها قابلة للإزالة في قطعة واحدة باستخدام ملقط فقط. يمكن تسهيل ذلك عن طريق تثبيت الملقط للخلف بحيث تقوم الأجزاء المنحنية (بدلا من النهايات) بتثبيت وسادة الدهون لإزالتها.
      1. إذا لزم الأمر ، اقطع وسادة الدهون بعيدا بمقص منحني. كرر ذلك مع وسادة الدهون الأخرى والأجنة الإضافية حسب الحاجة.
         ملاحظة: يمكن الحصول على ما مجموعه 80 ملغ من الدهون تحت الجلد من معظم الأجنة في E16 (الشكل 1C). ينتج عن هذا عادة ~ 1 × 10⁶ خلايا ، وهو ما يكفي للوحة قارورة T-25 واحدة. قد يكون من المفيد في هذه الخطوة وزن منصات الدهون من عدد قليل من الأجنة لتقييم كمية المواد الأولية ، حيث يمكن أن تختلف أوزان وسادة الدهون عبر خطوط دجاج التسمين المحددة ، وبسبب عوامل لا يمكن السيطرة عليها ، مثل عمر الدجاجة المربية والنظام الغذائي. تم جمع الدهون تحت الجلد بشكل روتيني من خمس بيضات لضمان إنتاجية كافية من الخلايا للطلاء في قوارير متعددة.
   4. انقل الأنسجة إلى ~ 5 مل من وسائط التجميع في أنبوب 15 مل وكرر تشريح البيض المتبقي.
   5. شطف لفترة وجيزة منصات الدهون التي تم جمعها عن طريق نقلها إلى طبق بتري 60 ملم يحتوي على محلول التعقيم وتدور الطبق عدة مرات.
   6. شطف محلول التعقيم عن طريق نقل منصات الدهون إلى طبق بتري 60 ملم يحتوي على 1x PBS. تدور بلطف. كرر هذه الخطوة عن طريق النقل إلى طبق بتري ثان 60 مم يحتوي على 1x PBS.
3. قم بإجراء عملية الهضم الأنزيمي وعزل الخلايا الدهنية باتباع الخطوات أدناه.
   1. انقل الأنسجة الدهنية إلى أنبوب 15 مل يحتوي على ~ 1 مل من محلول إنزيمي تم تسخينه مسبقا لكل 100 ملغ من الأنسجة. اغمر زوجا من المقصات الطويلة والمستقيمة في الأنبوب وقم بفرم الأنسجة الدهنية في المحلول إلى قطع صغيرة قدر الإمكان (~ 1 مم³) (الشكل 2A).
      ملاحظة: سيتم تقليل إنتاجية الخلايا إذا لم يتم فرم الأنسجة جيدا.
   2. انقل الأنسجة المفرومة والمحلول الأنزيمي إلى قارورة معقمة سعة 25 مل. لف القارورة بفيلم البارافين. ضعيه على شاكر مداري داخل الحاضنة ورجيه على حرارة 37 درجة مئوية أثناء خطوة الهضم.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم حمام مائي مهتز. مع أي من النهجين ، يجب أن تكون السرعة كافية لمنع قطع الأنسجة من الاستقرار في قاع القارورة ، ولكن يجب ألا تكون سريعة بحيث يتم دفع القطع إلى أعلى القارورة والالتصاق بالزجاج ، أو أن السائل يتراكم على غطاء فيلم البارافين.
   3. بعد حوالي 30 دقيقة ، اقطع نهاية طرف ماصة 1 مل إلى قطر 3 مم تقريبا. ماصة خليط الأنسجة لأعلى ولأسفل عدة مرات للمساعدة في إطلاق الخلايا من الأنسجة الدهنية. أعد القارورة إلى الحاضنة / الحمام المائي واستأنف الاهتزاز.
   4. بعد 15 دقيقة إضافية ، تحقق من القارورة للتأكد من اكتمال عملية الهضم. بعد إزالة القارورة من الخلاط ، ستتشكل طبقة من الخلايا البيضاء في الجزء العلوي من طبقة السائل. إذا بقيت شظايا الأنسجة ، فقم بقطع النهاية من طرف ماصة آخر وقم بماصة الخليط بلطف لأعلى ولأسفل ، ثم استمر في الاهتزاز لمدة 15 دقيقة إضافية.
      ملاحظة: يشبه خليط الأنسجة / الكولاجيناز المهضوم بالكامل الكيموس اللبني. عادة ، يتم هضم الأنسجة بشكل كاف بعد 1 ساعة من الاهتزاز اللطيف. إذا بقيت العديد من الشظايا في هذه المرحلة ، فقد يشير ذلك إلى وجود مشكلة في إنزيم الكولاجيناز المستخدم. الاهتزاز المستمر يمكن أن يزيد من الغلة. ومع ذلك ، فإن التعرض لفترات طويلة للإنزيم والإجهاد البدني قد يؤدي أيضا إلى تلف الخلايا.
   5. بعد الهضم ، ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لتخلط جيدا. قم بالتصفية من خلال مصفاة أنسجة سعة 250 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 15 مل عن طريق السحب لإزالة أي أجزاء من الأنسجة والحطام غير المهضوم.
      1. شطف القارورة مع 4 مل من وسائط النمو عن طريق السحب لإزالة الخلايا التي قد تكون ملتصقة بالزجاج، وتصفية في نفس أنبوب 15 مل. شطف المصفاة مع وسائط نمو إضافية عن طريق السحب لتخفيف أي خلايا محاصرة ، حتى حجم إجمالي من 14 مل.
   6. قم بتكوير جزء الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق في RT (7 دقائق لأنبوب 50 مل).
      ملاحظة: قم دائما بمسح الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل العودة إلى غطاء زراعة الخلية.
   7. شفط السوبرناتانت. احرص على عدم إزاحة حبيبات الخلية. أعد تعليق الكريات بلطف في 1 مل من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء (انظر جدول المواد) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضنها لمدة 5 دقائق في RT. سوف يتحول المحلول إلى اللون الأحمر مع تحلل خلايا الدم الحمراء (الشكل 2B).
      ملاحظة: ضع المخزن المؤقت لتحلل RBC في RT قبل الاستخدام. يحتوي الدجاج على خلايا دم حمراء نواة⁹ ، وهي تعلق على أطباق زراعة الأنسجة جنبا إلى جنب مع الخلايا الشحمية. يستخدم المخزن المؤقت لتحلل RBC لتحليل هذه الخلايا لمنع تداخلها مع عدد الخلايا الدقيق.
   8. أضف 5 مل من وسائط النمو إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا لتخفيف المخزن المؤقت للتحلل واخلطه بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. باستخدام ماصة ، قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنبوب جديد سعة 50 مل وشطف المصفاة ب 5 مل إضافية من وسائط النمو.
   9. خلايا الكريات عن طريق الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 7 دقائق في RT. قم بشفط السوبرناتانت بعناية وإعادة تعليق حبيبات الخلايا المتبقية في 1 مل من وسائط النمو عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
      1. استخدم مقياس الدم وعداد الخلايا وبقعة تريبان بلو لإحصاء الخلايا وتحديد صلاحية الخلية. خذ 10 ميكرولتر من العينة واخلطها مع 10 ميكرولتر من Trypan Blue عن طريق السحب. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخليط على مقياس الدم وقياس¹⁰.
         ملاحظة: يمكن زيادة سرعات الطرد المركزي إلى 600 × g إذا لم تكن كريات الخلايا الكافية مرئية بسهولة بعد الدوران الأولي.

3. البذر وزراعة الخلايا البدائية

1. البذور ~ 1 × 10⁶ خلايا في 4 مل من وسائط النمو قبل الاحترار في قارورة T-25. اتبع نفس كثافة الطلاء عند استخدام أنواع أخرى من أوعية الاستزراع. ضع في حاضنة زراعة الأنسجة واتركها تعلق بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: يتم استزراع الخلايا في حاضنة 38 درجة مئوية مع جو رطب من 5٪ CO₂. درجة الحرارة المثلى لنمو خلايا الطيور¹¹ هي 38 درجة مئوية ، وتنمو ببطء عند 37 درجة مئوية.
2. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسائط واغسل الخلايا بلطف باستخدام 1x PBS عن طريق السحب لإزالة الخلايا غير المرفقة أو الميتة. استبدل ب 4 مل من وسائط النمو الطازجة. تحقق من الخلايا تحت المجهر. يجب أن تكون الخلايا على شكل مغزل ، مثل الخلايا الليفية (الشكل 2A).
   ملاحظة: عادة ما تعلق الخلايا الدهنية بسرعة إلى حد ما (في غضون ساعات قليلة). يمكن تأكيد نجاح أو فشل عزل الخلايا في هذا الوقت (بعد 24 ساعة).
3. استبدل ب 4 مل من وسائط النمو الطازجة كل يومين والخلايا الفرعية أو الخلايا المحفوظة بالتبريد عندما تصل إلى التقاء 70٪ -80٪ (الشكل 3C).

4. التزريع الفرعي والحفظ بالتبريد

1. استنشاق الوسائط القديمة واغسل الخلايا بلطف باستخدام 4 مل من 1x PBS عن طريق السحب. قم بشفط PBS ، أضف 2 مل من 0.1٪ من التربسين لتغطية سطح الخلية في قارورة T-25 (اضبط الحجم وفقا لذلك لأوعية الاستزراع الأخرى) ، ثم احتضنها لمدة 3-4 دقائق عند 38 درجة مئوية.
   ملاحظة: لاحظ ما إذا كانت الخلايا منفصلة عن لوحة الزرع. اضغط على لوحة الثقافة بلطف للمساعدة في انفصال الخلايا. احتضان الخلايا مع التربسين لفترة طويلة جدا سوف يتلف الخلايا.
2. أضف حجما مكافئا من وسائط النمو التي تم تسخينها مسبقا لمنع تفاعل التربسين. ماصة على سطح الخلية عدة مرات ، وإمالة اللوحة لتخفيف الخلايا المتبقية.
3. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 300 × جم لمدة 5 دقائق عند RT (7 دقائق لأنبوب 50 مل). شفط السوبرناتانت.
4. في حالة الزراعة الفرعية ، أعد تعليق الكريات في 1 مل من وسائط النمو عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.3.9.1 ثم قم بتكرارها باستخدام نفس كثافة الطلاء المستخدمة في البداية في الخطوة 3.1.
5. في حالة الحفظ بالتبريد، قم بإعداد 4 مل من وسائط التجميد لقارورة T-25 مع التقاء بنسبة 90٪.
   ملاحظة: تتكون وسائط التجميد من 10٪ DMSO و30٪ FBS و60٪ DMEM/F12.
6. أعد تعليق بيليه الخلية في وسائط التجميد وانقل 1 مل من وسائط التجميد إلى تبريد. قم بتجميد الكريوفيات ببطء إلى -1 درجة مئوية / دقيقة باستخدام حاوية تجميد. ضع الحاوية في ثلاجة -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها ثم انقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
   ملاحظة: تحافظ الخلايا البدائية المحفوظة بالتجميد بشكل صحيح على بقائها لمدة 3 سنوات على الأقل وعادة ما تعمل مثل الخلايا المعزولة حديثا عند إذابتها وطلائها.

5. التمايز الأديبوجيني

ملاحظة: يمكن استخدام الألواح المطلية بالجيلاتين بنسبة 2٪ لتعزيز التصاق الخلايا.

1. تحضير محلول الجيلاتين 2٪ (ث / v) (انظر جدول المواد) في الماء المقطر. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة للتعقيم. سطح ثقافة المعطف مع 5-10 ميكرولتر من محلول الجيلاتين / سم 2 (أي 100-200 ميكروغرام / سم²). قم بالتدوير بلطف لتغطية السطح بالتساوي.
2. تحقق من الألواح بحثا عن انتشار محلول الجيلاتين لأن بعض المناطق قد تظل غير مغلفة في البداية. اسمح للصفيحة المطلية بالجيلاتين بالبقاء في RT لمدة 1 ساعة على الأقل. إزالة كامل حجم محلول الجيلاتين من الآبار.
   ملاحظة: هذا سيترك معطفا رقيقا من الجيلاتين في أسفل الآبار / الأطباق. يمكن إعادة استخدام محلول الجيلاتين عدة مرات (10 مرات على الأقل) دون تغيير التصاق الخلايا ونموها. اسمح للأطباق المغلفة بالجيلاتين بالبقاء في غطاء محرك الأنسجة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا.
3. حث الخلايا الشحمية الدجاج على الخضوع للتمايز الشحمي عن طريق استكمال وسائط النمو بالأحماض الدهنية. لإعداد وسائط التمايز الشحمية (ADM) ، قم بتكملة DMEM / F12 مع مصل الدجاج بنسبة 10٪ ، و 1x Linoleic Acid-Oleic Acid-Oleic Acid-Albumin (9.4 ميكروغرام / مل) ، و 1x P / S (انظر جدول المواد). اجعل ADM طازجا ودافئا قبل الاستخدام.
   ملاحظة: عادة ما يتم حث الخلايا الشحمية الدجاج على الخضوع للتمايز الشحمي المنشأ عن طريق استكمال الوسائط بالأحماض الدهنية بدلا من الكوكتيلات الهرمونية المستخدمة عادة للخلايا الشحمية من الأنواع الأخرى¹².
4. حث التمايز عن طريق استبدال وسائط النمو بوسائط التمايز الشحمية عندما تصل الخلايا إلى التقاء ~ 90٪. الحفاظ على الخلايا في هذه الوسائط ، واستبدالها كل 2 أيام. تقييم التمايز بصريا تحت المجهر (20x) على أساس تشكيل قطرات الدهون ، والتي تصبح مرئية بسهولة في غضون 48 ساعة من التمايز المحفز.

6. تقييم تكوين الدهون

1. قم بإجراء تلطيخ الزيت الأحمر O باتباع الخطوات أدناه.
   1. لوحة الخلايا في صفيحة من ستة آبار وحث التمايز الشحمي عند التقاء ~ 90٪.
   2. قم بإعداد حل عملي من Oil Red O من خلال الجمع بين ستة أجزاء من محلول مخزون Oil Red O مع أربعة أجزاء من الماء المقطر في أنبوب سعة 50 مل. اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل واتركيه لمدة 10 دقائق في RT ، ثم قم بالتصفية من خلال ورقة ترشيح من الدرجة 1 (انظر جدول المواد) داخل القمع عن طريق صب المحلول ببطء في أنبوب سعة 50 مل.
      ملاحظة: يتم تصنيع محلول مخزون Oil Red O عن طريق إذابة 0.7 جم من Oil Red O (انظر جدول المواد) في 200 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ في زجاجة معقمة. اخلطي جيدا واتركيه لمدة 20 دقيقة. يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية ويحفظ بعيدا عن الضوء حتى الاستخدام. هذا مستقر لمدة 1 سنة. يمكن استخدام حل العمل لمدة 3 ساعات ؛ ومع ذلك ، فمن المستحسن استخدامه في غضون 2 ساعة.
   3. قم بإزالة الوسائط واغسل الآبار بلطف مرتين باستخدام 2 مل من 1x PBS المسخن مسبقا باستخدام ماصة. قم بإزالة PBS تماما عن طريق إيقاف السحب. إصلاح الخلايا مع 2 مل من الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10 ٪ ولف اللوحة مع فيلم البارافين. اتركيه في RT لمدة 1 ساعة على الأقل وحتى 2 أيام قبل التلطيخ.
      ملاحظة: لصنع 1 لتر من محلول الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ ، امزج 100 مل من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ ، و 4.09 جم من NaH2 PO 4 ، و 6.5 جم من Na₂HPO₄ (انظر جدول المواد) ، و 900 مل من الماء المقطر. لا تقم بماصة الفورمالين مباشرة على الخلايا. يوزع بلطف على الجدار الجانبي بالقرب من قاع البئر.
   4. إزالة الفورمالين وغسل الآبار بلطف مع 2 مل من الماء المقطر. استبدل ب 2 مل من 60٪ أيزوبروبانول. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة الأيزوبروبانول واترك الآبار تجف تماما لمدة 10 دقائق. نفذ جميع خطوات التلطيخ في RT.
   5. أضف 1 مل من محلول عمل Oil Red O إلى الخلايا واحتضنه لمدة 10-20 دقيقة في RT. قم بإزالة البقعة عن طريق السحب واغسلها خمس مرات عن طريق الغمس في ماء الصنبور حتى لا تظهر أي بقعة زائدة. بعد الشطف النهائي ، أضف 1 مل من الماء إلى الخلايا قبل تصور التلطيخ وجمع الصور تحت المجهر.
   6. لتحديد تراكم الدهون في كل طبق ، قم بإزالة الماء واستخراج صبغة Oil Red O من الخلايا عن طريق إضافة 1-2 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ وهو ما يكفي لتغطية الخلايا في بئر من ستة آبار تماما. احتضن مع الهز اللطيف على شاكر الطبق لمدة 10 دقائق في RT.
   7. نقل 200 ميكرولتر من الاستخراج إلى بئر من لوحة الفحص 96 بئرا. حدد الكمية النسبية للبقع باستخدام قارئ لوحة مقياس الطيف الضوئي لقياس الامتصاص عند 495 نانومتر.
2. قم بإجراء فحص تلطيخ قطرات الدهون داخل الخلايا والنواة.
   1. خلايا الصفائح في ألواح 96 بئرا ذات القاع الأسود وتحفز التمايز الشحمي المنشأ كما هو موضح في الخطوة 5.3.
   2. لتلطيخ الخلايا ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التلطيخ الذي يحتوي على بقعة دهون فلورسنت وبقعة حمض نووي فلورسنت (انظر جدول المواد) في 1x PBS لكل بئر. بعد حساب الحجم الإجمالي للبقعة المطلوبة ، أضف قطرتين من بقعة الحمض النووي و 25 ميكرولتر من بقعة الدهون لكل مل من 1x PBS المسخن مسبقا باستخدام أنبوب ملفوف بالرقائق لحماية المحلول من الضوء. احتضان في RT لمدة 20 دقيقة وحماية من الضوء.
   3. اقرأ التألق باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت (انظر جدول المواد). الكشف عن بقعة الدهون (الإثارة: 485 نانومتر / الانبعاثات: 572 نانومتر) باستخدام مرشح أحمر وبقعة الحمض النووي (الإثارة: 359 نانومتر / الانبعاثات: 450 نانومتر) من خلال مرشح أزرق / سماوي.
      ملاحظة: يمكن أيضا تصور التلطيخ والتقاط الصور تحت المجهر الفلورسنت.
   4. تطبيع كثافة بقع الدهون إلى كثافة بقع الحمض النووي لتحديد تراكم الدهون بالنسبة للخلية رقم¹³.

النتائج

تشبه الخلايا الأولية البدائية من الناحية المورفولوجية الخلايا الليفية ، مع أشكال غير منتظمة تشبه النجوم ونواة مركزية (الشكل 2A-C). تلتصق الخلايا بسهولة بالبلاستيك المزروع بالأنسجة وتبدأ في التكاثر بعد فترة وجيزة من التعلق. فهي تميز بسرعة وتتراكم قطرات ال?...

Discussion

على الرغم من أن العديد من البروتوكولات الموصوفة جيدا قد أبلغت عن عزل الخلايا الشهية¹⁴،¹⁵،¹⁶،¹⁷ ، فقد تم تحسين عزل الخلايا الشهية الجنينية ^، والتي يمكن استخدامها للتحليلات الوظيفية لنمو الدهون في وقت مبكر من الحياة وتطورها في فر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette	Eppendorf	Z683825	Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL
1 mL Pipette Tip	Fisher Scientific	02-707-402
100% Isopropanol	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL Flask	Pyrex	4980-25
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F75P-1GAL
6-Well Plate	Falcon	353046	Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate	Costar	3632
96-Well Plate, Black Bottom	Costar	3603	Tissue Culture-treated
AdipoRed	Lonza	PT-7009
Amphotericin B	Gibco	15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper)	Kimberly-Clark	34155
Betadine	Up & Up	NDC 1167300334	20% Working Solution
Cell Counter	Corning	6749
Cell Strainer, 40 µm	SPL	93040
Centrifugaton	Eppendorf	5702
Chicken Serum	Gibco	16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	VWR	10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL	Falcon	352098
Cryovial	Nunc	343958
Curved Forceps, 100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
Distilled Water	Millipore	SYNSV0000	Despensed as needed
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
Ethanol	Decon Labs	2701	70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10437028
Fluorescent Microscope	EVOS	M7000
Fluorescent Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Foil	Reynolds		Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
Gelatin	Millipore	4055	2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber)	Corning	480200	0.1 mm deep
Incubator	Fisher Scientific	6845
Instrument Sterilizer	VWR	B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin	Sigma	L9655	1x Working Solution
Microscope	Evos	AMEX1000
Multi-Channel Pipette	Thermo Scientific	4661070	12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
Oil Red O	Sigma	O-0625
Orbital Shaker	IKA	KS130BS1
Paper Towel	Tork	RK8002
Parafilm	Parafilm M	PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S)	Gibco	15140122	1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm	Falcon	351029
Petri dishes, 60 mm	Falcon	351007
Plate Shaker	VWR	200
RBC Lysis Buffer	Roche	11814389001
Reagent Reservior	VWR	89094-680
Small Beaker, 100 mL	Pyrex	1000-100
Spectrophotometer Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Sterile Gauze	McKesson	762703
Straight Forceps, 120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
Straight Scissors, 140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 Flask	Corning	430639	Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	50144906
Tissue Strainer, 250 µm	Pierce	87791
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061
Trypsin	Gibco	15400054	0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
Type 1 Collagenase	Gibco	17100017
Water Bath	Fisher Scientific	15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-110