إنتاج مصل مكيف ذاتي معدل وتقييم خارج الجسم الحي لإمكاناته العلاجية في ظهارة قرنية الفئران

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا لتبسيط العملية وجعل تحضير المصل المشروط الذاتي (ACS) أقل تكلفة. ليست هناك حاجة إلى محاقن خاصة أو خرز زجاجي مطلي بالسطح. علاوة على ذلك ، فإن ACS المعدل (mACS) له مزايا تنافسية على المصل الذاتي التقليدي في التئام جروح القرنية لعيون الفئران خارج الجسم الحي.

Abstract

كانت العلاجات الموضعية المشتقة من الدم البشري نعمة للأطباء في العقود الأخيرة. يتم إثراء المصل الذاتي (AS) والبلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) بعوامل النمو الظهارية الضرورية في التئام جروح القرنية. على عكس AS ، يعتمد PRP على نظام الطرد المركزي التفاضلي ، مما ينتج عنه المزيد من عوامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية. المصل المكيف الذاتي (ACS) لا يحافظ فقط على إعداد AS و PRP ، ولكنه يركز أيضا على خصائص تعديل المناعة ، والتي تعتبر مهمة في الأمراض الالتهابية.

يعد الافتقار إلى البروتوكولات الموحدة وتكاليف التحضير المرتفعة قيودا على التطبيق السريري ل ACS. توضح تجربة الفيديو هذه إجراء تشغيليا قياسيا لتحضير قطرات العين المعدلة ذات المصل الذاتي المكيف (mACS). أولا ، تمت إضافة الجلسرين إلى محاقن الهيبارين كمثبت لخلايا الدم أثناء حضانة نقص الأكسجين. لتنشيط خلايا الدم ، بدأت حضانة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم طرد عينات الدم بالطرد المركزي عند 3500 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ترشيح المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، تم تحضير قطرات العين mACS بالكامل.

أظهرت تجربة مبدئية للتأثير العلاجي ل mACS أنه قد يكون له مزايا تنافسية على AS التقليدي في التئام جروح القرنية في عيون الفئران خارج الجسم الحي. تم إعداد AS المستخدم في هذه الدراسة وفقا للدراسات المنشورة والممارسة السريرية في مستشفانا. لذلك ، يمكن تقييم فعالية mACS على أمراض سطح العين في الأبحاث المستقبلية من خلال الدراسات الحيوانية في الجسم الحي والتجارب السريرية.

Introduction

تم الإبلاغ عن الآثار العلاجية للمصل الذاتي (AS) في أمراض جفاف العين لأول مرة في ثمانينيات القرن العشرين من قبل Fox et ^al.1. ويعتقد أن كل من خاصية التشحيم والمكونات الكيميائية الحيوية الأساسية الظهارية في AS، التي تحاكي الدموع الطبيعية، تفيد تكاثر الخلايا الظهارية القرنية. على مدى العقود الماضية ، تم إجراء العديد من الدراسات على هذا الأساس. تشمل المكونات الغذائية عامل نمو البشرة (EGF) وفيتامين أ وعامل النمو المحول β (TGF- β) والسيتوكينات الأخرى. ومن المثير للاهتمام أن المصل غني ب TGF- β وفيتامين أ ، والتي يعتقد أنها تلعب دورا محوريا في تكاثر البشرة²،^3،4،5. بالإضافة إلى ذلك ، عند علاج المرضى الذين يعانون من أمراض سطح العين ، أظهرت العديد من الدراسات بعض مزايا قطرات العين AS في النتائج التي أبلغ عنها المريض ، ومعلمات العين الجافة الموضوعية^{الأخرى 6,7} ، والنتائج المجهرية مثل كثافة الخلايا⁸. كشفت دراسات التحليل التلوي أنه قد تكون هناك بعض الفوائد في تحسين متلازمات المريض مع علاج قطرات العين AS ، ولكن النتائج والملاحظات على المدى الطويل لا تزال تفتقر إلى ^9,10.

على عكس AS ، يتم اشتقاق البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) من إضافة مضاد للتخثر أثناء التحضير ، مع مزيد من الطرد المركزي التفاضلي والتنشيط الكيميائي للصفائح الدموية. بالمقارنة مع AS ، توجد العديد من المواد الكيميائية وعوامل النمو ، مثل TGF- β ، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، و EGF ، في PRP. كما تم تطبيقه على أمراض سطح العين مع فوائد سريرية في تخفيف الأعراض¹¹.

العلاقة المتقاطعة بين العيوب الظهارية والالتهاب معقدة. والجدير بالذكر أن الفيزيولوجيا المناعية هي قضية مهمة أخرى في أمراض سطح العين. يعتقد أن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مثل IL-1β و IFN-γ ، هي وسطاء محوريون في الشلالات الالتهابية¹². وبالتالي يتم فتح طرق جديدة للعلاج على أساس فهم آلية المناعة. قد تلعب استراتيجيات إيقاف هذه العملية الالتهابية ، بما في ذلك إنتاج مضادات مستقبلات الإنترلوكين -1 (IL-1Ra) وغيرها من السيتوكينات المضادة للالتهابات ، دورا مهما في أمراض سطح العين¹³،^14،15.

منذ عام 1998 ، تم استخدام Orthokine ، وهو مصل مكيف ذاتي تجاري (ACS) ، سريريا في مرضى العظام الذين يعانون من هشاشة العظام (OA) والتهاب المفاصل الروماتويدي (RA) واضطرابات العمود الفقري¹³. بالمقارنة مع AS و PRP ، فإن العلاج بالخرز الزجاجي المطلي كيميائيا وحضانة نقص الأكسجين لتنشيط الخلايا الوحيدة هي السمات المحددة ل ACS¹⁶. من الناحية النظرية ، يمكن إفراز المزيد من العوامل المضادة للالتهابات عن طريق إضافة إجهاد البقاء على قيد الحياة إلى الخلايا ، مما يؤدي إلى تركيز أعلى من المكونات الأساسية المعدلة للمناعة ، بما في ذلك IL-1Ra. كما تم الإبلاغ عن الفوائد العلاجية المحسنة ل ACS في الزراعة العضوية ، مقارنة ب AS ،¹⁷. تشترك أمراض سطح العين في خلفيات مناعية مماثلة مع أمراض التهاب العظام في بعض النواحي. لذلك ، بناء على النتائج الناجحة للعلاج المشتق من الدم البشري في مجال تقويم العظام ، قد يكون ل ACS مزايا على العلاجات التقليدية في الممارسة السريرية من خلال خصائص الظهارة وتعديل المناعة. على الرغم من استخدام ACS على نطاق واسع في أمراض التهاب العظام ، إلا أن تطبيقاته السريرية في طب العيون لا تزال بحاجة إلى استكشاف ، والتي قد تعوقها تكلفتها العالية ، ونقص دعم الأدبيات ، وعدم توحيد عملية التحضير ، مما يؤدي إلى أداء متنوع.

في مقالة الفيديو هذه ، تم عرض طريقة جديدة وفعالة من حيث التكلفة ومريحة لتوليد ACS المعدل (mACS) ، أو البلازما الغنية بعوامل النمو (PRGF) ، مما ينتج عنه محلول قطرة العين بقيمة عملية مماثلة ل ACSs التجارية. تم الاحتفاظ بالأفكار الرئيسية لإضافة مضادات التخثر وتحفيز خلايا الدم على إفراز السيتوكينات المضادة للالتهابات عن طريق الحضانة المجهدة ، ولكن على عكس الطرق المستحثة كيميائيا ، مثل تلك القائمة على الخرز الزجاجي المطلي ب CrSO₄ والمجموعات التجارية ، يتم تحفيز حالة الإجهاد الحرجة جسديا عن طريق حضانة نقص الأكسجين في هذه الطريقة. علاوة على ذلك ، تمت إضافة الجلسرين لتوفير فوائد إضافية ، بما في ذلك زيادة استقرار غشاء خلايا الدم ، والحفاظ على ضغط السائل خارج الخلية التناضحي^{المناسب 18} ، ومصدر مناسب للمغذيات في حالات نقص الأكسجين التي تتجنب الإجهاد الزائد للخلايا.

Protocol

تم إجراء البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية في بداية قسم البروتوكول. تم تنفيذ جميع البروتوكولات والإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي وتمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمؤسسة تشانغ غونغ الطبية. تم إبلاغ جميع المتطوعين بطبيعة هذه الدراسة ووقعوا على نموذج موافقة مستنيرة قبل إدراجهم. يتم عرض المواد الاستهلاكية المطلوبة للإجراء التجريبي بأكمله في الشكل 1 والشكل 2 ، وكذلك في جدول المواد.

1. تحضير المواد اللازمة لإنتاج قطرات العين mACS

1. قم بإعداد 250 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ واحتفظ بمجموعة تسريب مجنحة الفراشة 21 جم ، ومحقنة سعة 3 مل بدون إبرة ، وستة أنابيب فراغ سعة 10 مل تحتوي على وحدات الهيبارين 158 USP جاهزة (الشكل 1).
2. قم بتوصيل إبرة جمع الدم 21 جم بالمحقنة سعة 3 مل واسحب 3 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ إلى المحقنة المعدة.
   ملاحظة: يجب تعقيم جميع المواد قبل إدخال الإبرة.
3. قم بتوزيع محلول الجلسرين بنسبة 10٪ في أنابيب الفراغ بالتسلسل ، مع ما يقرب من 0.5 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ في كل منها (الشكل 3 أ).
   ملاحظة: بسبب الضغط السلبي في أنبوب الاختبار ، يجب أن تخرج الإبرة فور دخولها لتوزيع 3 مل من محلول الجلسرين بالتساوي على أنابيب الاختبار الستة.
4. تعقيم جلد المريض بمسحات قطنية معقمة بنسبة 75٪ من الكحول. ثقب الوريد السطحي للأطراف العلوية للمريض بإبرة جمع الدم 18 جرام. ارسم 60-70 مل من الدم الوريدي من الوريد السطحي في المجموع.

2. التحضير لقطرات العين mACS

1. حقن 10 مل من الدم الوريدي المسحوب بالتتابع في كل من الأنابيب الفراغية الستة (الشكل 3 ب).
   ملاحظة: تعتمد هذه الخطوة على الضغط السلبي للفراغ لملء الأنابيب. لتجنب اضطراب خلايا الدم وانحلال الدم ، لا تمارس أي ضغط إيجابي.
2. ضع الأنابيب الفراغية الستة في الحاضنة بدرجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات (الشكل 3C).
   ملاحظة: يتم الحفاظ على حالة نقص الأكسجين واستقرارها من خلال الضغط السلبي المتبقي في أنبوب مغلق يتلقى الجلسرين.
3. قم بإزالة الأنابيب من الحاضنة بعد 4 ساعات وطردها مركزيا عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. في هذه المرحلة ، قم بإعداد المواد لاستخراج mACS ، بما في ذلك زجاجات قطرة العين المعقمة ، ومحقنة 3 مل بالإبرة ، ومرشح 0.22 ميكرومتر ، وإبرة 18 جم ، وزوج من القفازات المعقمة (الشكل 2).
   ملاحظة: يجب مسح طاولة العمليات بنسبة 75٪ كحول لضمان بيئة معقمة. الطافي ، بعد الطرد المركزي ، هو بالفعل منتج نصف نهائي من mACS.
5. ضع الأنابيب الستة على رف الأنبوب وافتح الأغطية بعد الطرد المركزي الكامل (الشكل 3D).
   ملاحظة: العقم غير مطلوب في هذه الخطوة.
6. ارتد قفازات معقمة واسحب mACS واحدا تلو الآخر باستخدام حقنة سعة 3 مل بإبرة 18 جرام.
   ملاحظة: احرص على عدم رسم طبقة خلايا الدم السفلية خلال هذه الخطوة (الشكل 3E).
7. اسحب الإبرة ، وقم بتوصيلها بمرشح 0.22 ميكرومتر ، وقم بتوصيل إبرة جمع الدم 23 G ، 1.5 بوصة مع المحقنة الأصلية 3 مل بالمخرج أدناه (الشكل 3F).
8. ادفع الإبرة برفق من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجات قطرة العين المعقمة المعدة (الشكل 3G).
9. كرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى يتم ترشيح جميع mACS وتخزينها في زجاجات قطرة العين (الشكل 3H).
10. قم بتخزين قطرات العين mACS على حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري ؛ يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية للحفظ على المدى الطويل.
    ملاحظة: لا تحتفظ بها لأكثر من أسبوعين عند 4 درجات مئوية أو لمدة تزيد عن 3 أشهر عند -20 درجة مئوية ^9,19.

3. نموذج التئام الجروح خارج الجسم الحي لظهارة القرنية الفئران

ملاحظة: استند النموذج الحيواني خارج الجسم الحي التالي إلى خبرة سابقة من Hung et al. على الإصابات الميكانيكية لظهارة القرنية²⁰. يجب تنفيذ الخطوات التالية تحت المجهر لإنشاء جرح ظهاري للقرنية محدد جيدا ومتناسق.

1. تخدير الفئران C57BL / 6 مع 3٪ -4٪ إيزوفلوران. ضع مسافة بادئة لكمة خزعة الجلد فوق القرنية المركزية للفأر ، تاركا دائرة ضحلة على الظهارة كهامش جرح موحد.
   ملاحظة: كن لطيفا لتجنب تمزق مقلة العين.
2. قم بإزالة ظهارة القرنية داخل المنطقة المؤكدة وصولا إلى طبقة بومان ، باستخدام مزيل حلقة صدأ القرنية المجهز بلدغ 0.5 مم.
3. لإنشاء نموذج حيواني خارج الجسم الحي لجرح القرنية الميكانيكي ، قم بحصاد مقلة العين وإعداد الثقافة جيدا.
   1. القتل الرحيم للفئران أولا ؛ بعد ذلك ، اضغط برفق على الحافات المدارية العلوية والسفلية للفئران ، وأدخل طرف الملقط فوق الفضاء الخلفي ، وأخرج مقلة العين وأمسكها بالملقط.
   2. قطع العصب البصري والأنسجة الرخوة حول الحجاج بمقص القرنية لعزل مقلة العين بشكل مثالي.
   3. تحضير لوحة 96 بئرا مع الشمع المذاب بداخله. قم بإنشاء ثقب دائري بسرعة باستخدام أطراف الملقط ثم انتظر التصلب.
4. تحضير الوسائط المراد اختبارها: 0.5٪ mACS ، 0.5٪ AS للمقارنة ، محلول ملحي عادي كعنصر تحكم سلبي ، ووسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM).
   ملاحظة: يتم الحصول على mACS باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه.
5. بالنسبة للثقافة خارج الجسم الحي ، ضع مقلة العين المحصودة على اللوحة المعدة المكونة من 96 بئرا. أضف 200 ميكرولتر من كل وسيط إلى لوحة 96 بئرا.
6. ضع صفيحة الاستزراع المكونة من 96 بئرا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. التأكد من تغيير الإعلام الثقافي كل 24 ساعة.
7. لتأكيد تأثير التئام الجروح المتسلسل ، راقب منطقة الجرح الظهاري تحت المجهر كل 8 ساعات عن طريق تلطيخ الفلوريسين.
   1. حل الفلوريسئين على ورقة الفلوريسئين مع المياه المالحة العادية.
   2. أسقط صبغة الفلوريسئين على القرنية المركزية للفأر ، ثم راقبها ووثقها تحت المجهر. تظهر نتيجة نموذجية في الشكل 4.
      ملاحظة: قطرة واحدة (حوالي 0.05 مل) من صبغة الفلوريسئين كافية للمراقبة.

النتائج

يوضح الشكل 1 والشكل 2 المواد اللازمة للتجربة ، ويعرض الشكل 3 الخطوات المتسلسلة والمنتجات المتوسطة الناجحة أثناء تحضير mAcs. أولا ، تمت إضافة 0.5 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ إلى كل أنبوب اختبار معقم سعة 10 مل (الشكل 3 أ). ثم ، تم الح...

Discussion

في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول لإعداد mACS وتظهر فائدة قطرات العين mACS في التئام الجروح للنماذج الحيوانية. التعديل الحاسم لبروتوكول mACS هذا هو إضافة ما يقرب من 0.5 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ في كل أنبوب اختبار ، مما يخلق ظروفا مناسبة لنقص الأكسجين خلال فترة الحضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004