JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

دفعت زيادة المؤشرات الحيوية الجزيئية التي سيتم اختبارها لإدارة رعاية سرطان الرئة ذو الخلايا غير الحرشفية غير الصغيرة (NS-NSCLC) إلى تطوير طرق سريعة وموثوقة للكشف الجزيئي. نحن نصف سير عمل لتقييم التغيير الجينومي لمرضى NS-NSCLC باستخدام نهج تسلسل الجيل التالي فائق السرعة (NGS).

Abstract

زاد عدد التعديلات الجزيئية التي سيتم اختبارها للعلاج الموجه لمرضى سرطان الرئة ذو الخلايا غير الحرشفية غير الصغيرة (NS-NSCLC) بشكل كبير في السنوات القليلة الماضية. يعد اكتشاف التشوهات الجزيئية إلزاميا للرعاية المثلى لمرضى NS-NSCLC المتقدمين أو النقيلي ، مما يسمح بإدارة العلاجات المستهدفة مع تحسين البقاء على قيد الحياة بشكل عام. ومع ذلك ، فإن هذه الأورام تطور آليات مقاومة يمكن استهدافها باستخدام علاجات جديدة. يمكن لبعض التغيرات الجزيئية أيضا تعديل استجابة العلاج. يجب إجراء التوصيف الجزيئي ل NS-NSCLC في وقت قصير (TAT) ، في أقل من 10 أيام عمل ، على النحو الموصى به في المبادئ التوجيهية الدولية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أصل خزعات الأنسجة للتحليل الجينومي متنوع ، ويتناقص حجمها باستمرار مع تطوير طرق وبروتوكولات أقل توغلا. وبالتالي ، يواجه أخصائيو علم الأمراض تحديا لأداء تقنيات جزيئية فعالة مع الحفاظ على استراتيجية تشخيص فعالة وسريعة. هنا ، نصف سير عمل تسلسل الجيل التالي (NGS) فائق السرعة القائم على amplicon المستخدم في الممارسة الروتينية اليومية عند التشخيص لمرضى NS-NSCLC. لقد أظهرنا أن هذا النظام قادر على تحديد الأهداف الجزيئية الحالية المستخدمة في الطب الدقيق في علم الأورام الصدري في TAT مناسب.

Introduction

على مدى العقد الماضي ، أدى تطوير العلاجات المستهدفة والمناعية إلى زيادة كبيرة في البقاء على قيد الحياة بشكل عام (OS) لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الحرشفية غير الصغيرة (NS-NSCLC) 1,2. في هذا الصدد ، زاد عدد الجينات الإلزامية والأهداف الجزيئية التي يجب تحليلها عند معالجة NS-NSCLC خلال السنوات القليلة الماضية 3,4.

توصي الإرشادات الدولية الحالية باختبار EGFR و ALK و ROS1 و BRAF و NTRK و RET و MET عند تشخيص NS-NSCLC5 المتقدم. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الأدوية الجديدة أعطت مؤخرا نتائج واعدة للغاية في التجارب السريرية ، سيتم قريبا فحص تعديلات جينومية إضافية في عدد من الجينات الإضافية ، ولا سيما KRAS و HER2 ، جنبا إلى جنب مع BRAC1 / BRAC2 و PI3KA و NRG1 و NUT6،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون حالة الجينات المرتبطة المختلفة ، مثل STK11 و KEAP1 و TP53 ذات أهمية قوية للتنبؤ بشكل أفضل بالاستجابة أو المقاومة لبعض العلاجات المستهدفة و / أو مثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs)10،11،12.

الأهم من ذلك ، يجب الإبلاغ عن التغيرات الجزيئية دون تأخير كبير لضمان اتخاذ القرارات السريرية بعناية. قد يؤدي غياب التوصيف الجزيئي للورم إلى بدء علاجات غير مستهدفة مثل العلاج الكيميائي مع / بدون علاج مناعي ، مما يؤدي إلى استراتيجية علاج دون المستوى الأمثل ، حيث أن استجابة العلاج الكيميائي محدودة في المرضى الذين يعانون من تغيرات قابلة للتنفيذ ، مثل طفرات EGFR أو اندماج الجينات13.

علاوة على ذلك ، فإن التطوير الحالي للعلاجات المستهدفة / العلاجات المناعية في الإعدادات المساعدة الجديدة و / أو المساعدة يمكن أن يؤدي إلى البحث بشكل منهجي ، على الأقل ، عن تغييرات EGFR و ALK في المرحلة المبكرة من NS-NSCLC حيث يجب إعطاء ICIs فقط في الأورام البرية ل EGFR و ALK14. أصبح الآن إلزاميا أيضا اختبار وجود طفرات EGFR في المرحلة المبكرة من NS-NSCLC ، حيث يمكن استخدام osimertinib (الجيل الثالث من مثبطات EGFR التيروزين كيناز) كعلاج مساعد في NS-NSCLC15 المتحور EGFR.

تتحرك استراتيجية تقييم المؤشرات الحيوية المختلفة في التنبؤ بالاستجابة للعلاجات المستهدفة المختلفة و / أو العلاجات المناعية لدى مرضى NS-NSCLC بسرعة ، مما يجعل تحديد هذه المؤشرات الحيوية أمرا صعبا بالتتابع 3,16. في هذا الصدد ، يعد تسلسل الجيل التالي (NGS) الآن هو النهج الأمثل للتقييم المتوازي عالي الإنتاجية للتغيرات الجينية في NS-NSCLC 5,17.

ومع ذلك ، قد يكون من الصعب إتقان سير عمل NGS وقد يستمر لفترة أطولTAT 18,19. وبالتالي ، لا تزال العديد من المراكز تؤدي مناهج متسلسلة (الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) ، التهجين الفلوري في الموقع (FISH) و / أو التسلسل المستهدف). ومع ذلك ، فإن هذه الاستراتيجية محدودة في حالة صغر حجم العينة ، وقبل كل شيء ، بسبب زيادة عدد الطفرات القابلة للتنفيذ المطلوب اختبارها في NS-NSCLC20. وبالتالي ، أصبحت طرق الاختبار فائقة السرعة والمباشرة التي تسمح بالتقييم السريع للتغيرات الجينية ذات أهمية متزايدة لاتخاذ القرارات السريرية المثلى. علاوة على ذلك ، أصبحت الأنظمة المعتمدة والمعتمدة للاختبار الجزيئي إلزامية لوصف علاجات مستهدفة محددة.

هنا ، نصف مقايسة DNA / RNA NGS فائقة السرعة والآلية القائمة على amplicon للاختبار الجزيئي ل NS-NSCLC المستخدم في مختبر مختبر علم الأمراض السريري والتجريبي (LPCE) ، مستشفى جامعة نيس ، فرنسا وهو معتمد وفقا لمعيار ISO 15189 من قبل لجنة الاعتماد الفرنسية (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). تشهد COFRAC بأن المختبر يفي بمتطلبات قواعد تطبيق ISO 15189 و COFRAC القياسية لأنشطة الاختبار / المعايرة في التحليل الجزيئي في NGS الآلي على جهاز التسلسل مع اللوحة التي يقوم بها المختبر. يوضح الاعتماد وفقا للمعيار الدولي المعترف به ISO 15189 الكفاءة الفنية للمختبر لنطاق محدد والتشغيل السليم لنظام إدارة مناسب في هذا المختبر. تتم مناقشة فوائد وقيود سير العمل هذا ، بدءا من إعداد عينات خزعة الأنسجة إلى الحصول على التقرير.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (لجنة أخلاقيات البحوث البشرية ، المركز الاستشفائي الجامعي في نيس ، Tumorothèque BB-0033-00025). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى لاستخدام العينات والبيانات التي تم إنشاؤها. تم الحصول على جميع العينات من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم ب NS-NSCLC في LPCE (نيس ، فرنسا) بين 20 سبتمبر و 31 يناير 2022 كجزء من الرعاية الطبية.

1. تحضير عينات الحمض النووي والحمض النووي الريبي FFPE باستخدام أداة تنقية آلية (API) (وقت المعالجة: 5 ساعات و 15 دقيقة)

  1. قم بتشغيل التخطيط على الأداة.
    1. قم بتشغيل الجهاز وتسجيل الدخول باستخدام اسم المستخدم وكلمة المرور (جدول المواد). قم بإنشاء خطة تشغيل تنقية بالنقر فوق تشغيل، ثم إضافة خطة، وبإعطاء اسم لخطة التشغيل.
    2. بعد ذلك ، حدد مجموعة وبروتوكول التنقية المناسبين لتنقية الحمض النووي والحمض النووي الريبي بالتتابع من عينات البارافين المضمنة في الفورمالين (FFPE). تمكين الكمي بعد التنقية.
    3. حدد حجم الشطف المطلوب (50 ميكرولتر) من القائمة المنسدلة ، ثم انقر فوق التالي. حدد عدد العينات التي سيتم استخراجها.
    4. ثم حدد كل نموذج، وانقر فوق تحرير، وأدخل نموذج المعرف، ثم انقر فوق حفظ.
  2. تحضير عينات الحمض النووي والحمض النووي الريبي FFPE باستخدام GPI
    1. تحضير عينات أنسجة FFPE (4 أقسام قطع من 10 ميكرومتر مع ميكروتوم) أو إجراء تشريح كبير مباشرة على كتل FFPE. ضع كل عينة من أنسجة FFPE في أنابيب معالجة عينات FFPE منفصلة ومحددة (جدول المواد).
    2. أجهزة الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 1 دقيقة لجمع الأنسجة في الجزء السفلي من الأنابيب.
    3. أضف إلى كل أنبوب معالجة عينة FFPE مزيجا رئيسيا من هضم البروتياز محضر من مجموعة تنقية الحمض النووي واحتضانه عند 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل (جدول المواد). احتضان العينات على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    4. بعد الحضانة ، اترك العينات تبرد لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. لكل أنبوب معالجة عينة FFPE ، ارفع الأنبوب الداخلي ، وقفله عن طريق الانعطاف يسارا ، ثم طرد العينات عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق.
    6. افتح الأنابيب الداخلية عن طريق الانعطاف يمينا ، وافصلها عن الأنابيب الخارجية ، وتخلص منها. احتفظ بالعينات في الأنابيب الخارجية على الجليد حتى التحميل على واجهة برمجة التطبيقات.
    7. قم بإعداد مزيج رئيسي لهضم DNase وقم بتحميله في لوحة تنقية الحمض النووي والحمض النووي الريبي FFPE المعبأة مسبقا 2. بعد ذلك ، قم بتحميل العينات المحضرة في لوحة تنقية الحمض النووي والحمض النووي الريبي FFPE 1 (جدول المواد).
  3. ابدأ تشغيل التنقية على واجهة برمجة التطبيقات.
    1. في شاشة واجهة برمجة التطبيقات، انقر على تشغيل، وحدد خطة التشغيل، ثم انقر على التالي.
    2. اتبع المؤشرات التي تظهر على الشاشة لتحميل واجهة برمجة التطبيقات بالمواد الاستهلاكية والكواشف المطلوبة اللازمة لتشغيل التنقية (جدول المواد).
    3. عند تحميل كافة الكواشف ، انقر فوق التالي. أغلق باب واجهة برمجة التطبيقات وانقر فوق ابدأ.
    4. في نهاية الجري ، انقر فوق "تفريغ " على شاشة اللمس وقم على الفور بإزالة لوحة أرشيف الحمض النووي المكونة من 48 بئرا والتي تحتوي على عينة الحمض النووي المنقاة والحمض النووي الريبي.
    5. تصدير نتائج الكمية. أغلق اللوحة وقم بتخزين العينات النقية عند -80 درجة مئوية. انقل لوحة البئر 96 إلى جهاز التسلسل ليتم تحليلها.
  4. إنشاء عينة وإنشاء تشغيل.
    1. افتح البرنامج وقم بتسجيل الدخول إليه، ثم اختر في شريط القائمة نماذج وانقر على إنشاء عينة.
    2. أدخل اسم العينة وجنسها والنسبة المئوية للخلايا السرطانية ، وأكمل الحقول المطلوبة والحقول الاختيارية إذا لزم الأمر.
    3. احفظ التفاصيل (الجنس والنسبة المئوية للخلايا السرطانية مهمة لتحليل متغيرات رقم النسخ [CNVs]).
    4. اختر تشغيل وحمض نووي لينتج عنه شريط القائمة.
    5. أدخل اسم التشغيل في خطوة الإعداد . انقر فوق التالي.
    6. حدد الفحص في خطوة المقايسات . انقر فوق التالي.
    7. حدد العينات في خطوة العينات للتشغيل باستخدام الفحص.
    8. ثم في جزء المقايسات المحددة ، انقر فوق تعيين. انقر فوق التالي.
    9. راجع مواضع العينة على لوحة إدخال العينة. انقر فوق التالي.
    10. راجع ملخص خطة التشغيل، ثم حفظ وطباعة أو حفظ.

2. NGS الآلي على جهاز التسلسل (وقت المعالجة: 30 دقيقة)

  1. قم بتحميل لوحة العينة.
    ملاحظة: تركيز الحمض النووي الأمثل هو 0.5 نانوغرام / ميكرولتر. نطاق تركيز الحمض النووي الذي تم التحقق من صحته هو 0.33-1 نانوغرام / ميكرولتر. بالنسبة للحمض النووي والحمض النووي الريبي ، تم التحقق من تركيز 1 نانوغرام / ميكرولتر في المختبر.
    1. يتطلب جهاز التسلسل حجما إجماليا قدره 20 ميكرولتر. تأكد من وجود حجم كاف لتحميل العينة.
    2. إضافة ضوابط إيجابية (الحمض النووي والحمض النووي الريبي) و NTC (الحمض النووي والحمض النووي الريبي) إلى المرحلة 1 من أداة تنقية دون أن يتم استخراجها. استخدم عناصر تحكم DNA و RNA لكل تشغيل للتحقق من صحة التشغيل والتحقق من صحة الدفعات المستخدمة. أضف عناصر تحكم DNA و RNA إلى اللوحة في نهاية تشغيل API.
  2. قم بتحميل جهاز التسلسل وابدأ التشغيل.
    1. قم بإزالة جميع الكواشف من صناديقها في الثلاجة أو الفريزر وقم بإذابة الثلج في RT لمدة لا تقل عن 30 دقيقة (جدول المواد) وبحد أقصى 12 ساعة.
    2. في المختبر ، حافظ على تشغيل جهاز التسلسل دائما باتباع النصائح التي قدمها المورد أثناء التدريب في الموقع. سجل الدخول إلى النظام.
    3. قم بتحميل اللوحة من أداة التنقية ، التي تحتوي على عينات ، بعد إغلاق اللوحة بورقة من رقائق لوحة PCR اللاصقة (جدول المواد).
    4. تثبيت جميع المواد الاستهلاكية في سطح السفينة. يوفر جهاز التسلسل إرشادات خطوة بخطوة لتحميل كل مستهلك مطلوب في موضع مميز (جدول المواد).
    5. تأكد من عدم وجود ترسبات على الأنبوب 3 من Strip 2-HD. حرك الأنبوب أو قم بدوامة الشريط برفق لإذابة الراسب إذا لزم الأمر.
    6. يحتوي الشريط 1 والشريط 3 على خرز مغناطيسي. هذه الخطوة حاسمة للغاية: تأكد من إعادة استخدام الخرز. يجب ألا يكون هناك خرز متبقي في الجزء العلوي من الأنبوب.
    7. اقلب الشريط رأسا على عقب وعاد 3-4 مرات لإزالة الخرز. أمسك الشريط في أحد طرفيه مع توجيه ختم الشريط لأعلى. بعد ذلك ، قم بتأرجح الشريط بسرعة لأسفل باستخدام حركة ذراع سريعة بالطرد المركزي ، وانتهي بنقرة حادة من المعصم.
    8. أجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 15 ثانية. كرر إذا لزم الأمر. أجهزة الطرد المركزي الشرائط مع المحولات وحوامل الشريط لتقليل حالات الفشل التي لوحظت بشكل عشوائي فيما يتعلق ببقايا الكرات في الجزء العلوي من الشرائط.
    9. أغلق النظام وانقر فوق التالي. قم بتركيب أبواب خليج كواشف التسلسل (جدول المواد). أغلق النافذة. يبدأ جهاز التسلسل التشغيل تلقائيا.
  3. تنظيف
    1. للتنظيف بعد التشغيل، عند اكتمال التشغيل، انقر فوق التالي.
    2. يفتح الباب على التوالي. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لتفريغ النفايات وإزالة جميع المواد الاستهلاكية. انقر فوق التالي.
    3. أغلق المجموعة عند الانتهاء، وانقر فوق التالي. يبدأ التنظيف بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 دقيقة. جهاز التسلسل جاهز لبدء تشغيل جديد.

3. تحليل النتائج باستخدام البرنامج المتكامل (وقت التحليل من قبل المريض [عينات ADN و ARN]: 15 دقيقة)

ملاحظة: تم اعتماد هذه التقنية من قبل لجنة الاعتماد الفرنسية (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)

  1. البيانات والنتائج
    1. حدد نتيجة تشغيل أو نتيجة عينة في قائمة النتائج . في شاشة النتائج/تشغيل النتائج ، يتم سرد كافة عمليات التشغيل.
    2. ابحث في قائمة النتائج عن طريق التصفية في رأس عمود.
    3. انقر فوق النتائج وانقر فوق نتائج نموذجية. ثم انقر فوق اسم عينة الاهتمام في عمود اسم العينة لعرض نتائج التسلسل لعينة فريدة.
    4. انقر فوق الأعمدة في الزاوية العلوية اليمنى من الشاشة أو قم بإلغاء تحديد الأعمدة من الجدول.
  2. عرض نتائج مراقبة الجودة وعرض تغطية amplicon.
    1. انقر فوق علامة التبويب مراقبة الجودة في شاشة النتائج .
    2. بالنسبة للحمض النووي ، تأكد من أن متوسط الاختلافات الزوجية المطلقة (MAPDs) يتراوح بين 0 و 0.5 للتحقق من صحة تحليل متغيرات رقم النسخ (CNV). يجب أن تكون القراءات المعينة أكبر من 1.5 مليون.
    3. بالنسبة للحمض النووي الريبي ، تحقق مما إذا كانت القراءات المعينة تتراوح بين 150,000 و 400,000. أقل من ذلك ، هناك خطر من السلبيات الكاذبة ، وبعد ذلك ، هناك خطر من الإيجابيات الكاذبة.
    4. انقر فوق اسم عينة لفتح علامة التبويب النتائج الرئيسية .
    5. قم بالتمرير إلى الرسوم البيانية لتغطية amplicon.
    6. راجع الرسوم البيانية للتغطية. حدد الحد الأدنى لتغطية amplicon ، حيث لا يوفرها المورد. لتحديد نطاق وعتبة، امزج عنصر تحكم وعينة من النوع البري (WT). بعد ذلك ، لاحظ أصغر قيمة لتغطية amplicon لطفرة واحدة أو أكثر مختارة.
  3. عرض نتائج المتغيرات.
    1. لتصدير البيانات بتنسيق جدولي، انقر فوق تصدير في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.
    2. لعرض نتيجة متغير النوكليوتيدات المفردة/متغير الإدراج والحذف (SNV/INDEL)، انقر على علامة التبويب المتغيرات ، ثم انقر على SNVs/Indels. انقر على تحرير الفلاتر وحدد بلا فلتر.
      ملاحظة: تم تحديد عتبة الحساسية عند 5٪ وفقا لتوصيات مجموعة INCA (المعهد الوطني الفرنسي للسرطان) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes).
    3. عرض نتائج الاندماج وعرض متغيرات إكسون الحمض النووي الريبي: انقر على علامة التبويب المتغيرات ، ثم انقر على عمليات الدمج.
    4. في أعلى يسار الصفحة، انقر على المرئيات ومتغير إكسون الحمض النووي الريبي، ثم راجع مخطط متغيرات إكسون الحمض النووي الريبي.
    5. باستخدام هذه المجموعة ، يمكن اكتشاف تخطي إكسون لجينات EGFR و MIT و AR . انقر فوق التصور; من الأسهل تحليلها.
    6. عرض اختلال توازن دمج بلاط إكسون الحمض النووي الريبي: انقر على علامة التبويب المتغيرات ، ثم انقر على عمليات الدمج.
    7. في أعلى يسار الصفحة، انقر على المرئيات واختلال توازن دمج بلاط إكسون الحمض النووي الريبي، ثم راجع مخططات اختلال توازن دمج بلاط إكسون الحمض النووي الريبي. اندماج عدم التوازن هو اندماج بين شريك معروف وشريك لا تغطيه اللجنة.
    8. عرض نتائج CNV: انقر على CNVs في علامة التبويب المتغيرات لعرض البيانات.
      ملاحظة: من الضروري توخي الحذر مع نتائج CNV من خلال الإبلاغ أثناء إعداد عينات الجنس والنسبة المئوية للخلايا السرطانية للعينة. يحمل الكروموسوم X جين AR فقط. إذا لم يتم تحديد الجنس ، فقد يواجه جنس الذكور خسائر ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة في المرضى الذكور.
  4. مراجعة نتائج المكون الإضافي.
    1. مراجعة نتائج المكون الإضافي لتحليل التغطية : في أعلى يسار الصفحة، انقر على تنزيل الملفات وحدده.
    2. ينشئ المكون الإضافي لتحليل التغطية تقرير تحليل التغطية.
    3. مراجعة نتائج المكون الإضافي لتحليل التغطية الجزيئية: في أعلى يسار الصفحة، انقر على تنزيل الملفات وحدده. يتحقق هذا التحليل مما إذا كانت جميع الأمبليكونات مغطاة ويؤكد نتائج متغيرات رقم النسخ (CNVs) التي يوفرها البرنامج.
  5. عرض مقاييس الفحص وتقرير التشغيل
    1. انقر فوق علامة التبويب تشغيل التقرير في ملخص التشغيل.
    2. لعرض تقرير التشغيل، حدد الخيار تحديد عينة في القائمة المنسدلة.
    3. مقاييس الفحص وتقرير التشغيل: ابحث عن مقاييس التسلسل في أعلى الشاشة، متبوعة بمقاييس خاصة بالعينة في جدول تشغيل العينات .
      ملاحظة: يمكن أن تساعد المعلومات الموجودة في ملف أرشيف دعم العملاء (CSA) في استكشاف النتائج وإصلاحها، ولكن لا يمكن تحليلها مباشرة. تلخص ملفات CSA بيانات بيانات التشغيل بالكامل وتسلط الضوء على أسباب المشكلة في حالة فشل التشغيل.
    4. تنزيل تقرير تشغيل: انقر على علامة التبويب التقارير .
    5. انقر فوق تنزيل التقرير لتنزيل ملخص تقرير التشغيل بتنسيق PDF.
  6. إنشاء تقرير متغير.
    1. قم بتمكين إنشاء تقرير في خطوة الإعداد لإنشاء تقرير متغير تلقائيا لكل عينة أثناء تحليل بيانات التشغيل.
    2. بعد إنشاء تقرير المتغير لعينة، يجعل النظام التقرير متاحا في مكانين: أولا، يتم توفير ارتباط في شاشة النتائج/نتائج العينة . انقر على الرابط لتنزيل ملف PDF.
    3. ثانيا ، انتقل إلى جزء تقرير المتغير في علامة التبويب التقارير وانقر فوق الزر تنزيل التقرير . توقيع تقارير المتغيرات إلكترونيا أو يدويا.
      ملاحظة: تحتوي التقارير الموقعة إلكترونيا على (تسجيل الخروج) بعد اسم العينة في شاشة نتائج العينة .

النتائج

باستخدام الإجراء المقدم هنا ، الموضح بالتفصيل في منشوراتنا الأخيرة21 ، قمنا بتطوير سير عمل مثالي لتقييم التغيير الجزيئي كاختبار منعكس في الممارسة السريرية التي يتم إجراؤها بشكل روتيني للتشخيص في المرضى الذين يعانون من NS-NSCLC باستخدام نهج تسلسل الجيل التالي القائم على amplicon فائ...

Discussion

يعد تطوير نهج NGS فائق السرعة القائم على amplicon كاختبار منعكس لتقييم التغيير الجزيئي عند تشخيص أي مرحلة NS-NSLC خيارا مثاليا للكشف عن جميع المؤشرات الحيوية الموصى بها والناشئة في NS-NSCLC5،22،23. في حين أن الطرق المتسلسلة (IHC ، PCR ، FISH) تركز فقط على جينا...

Disclosures

يشارك كريستوف بونتو في أنشطة المتحدثين المدفوعة ويتلقى مزايا من Thermo Fisher Scientific. يشارك بول هوفمان في أنشطة المتحدث المدفوعة ويتلقى مزايا وتمويلا من Thermo Fisher Scientific.

Acknowledgements

نشكر Thermo Fisher Scientific لمنحنا إمكانية استخدام أجهزتهم وموادهم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well hard shell plate clearThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)4483354
Adhesive PCR Plate FoilThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)AB0626
AutoLys M tube Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A38738FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HDThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus CouplerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40269
Genexus Pipette TipsThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40266
Genexus Purification InstrumentThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A48148Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing KitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40263
Genexus Integrated SequencerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo KitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A46291

References

  1. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  2. Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
  3. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
  4. Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
  5. Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
  6. Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
  7. Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
  8. Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
  9. Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
  10. Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
  11. Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
  12. Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
  13. Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
  14. Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
  15. Wu, Y. -. L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
  16. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
  17. de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
  18. DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
  19. Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
  20. Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
  21. Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
  22. Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
  23. Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
  24. Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
  25. Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
  26. Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
  27. Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
  28. Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
  29. Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
  30. Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
  31. Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
  32. Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
  33. Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
  34. Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
  35. Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
  36. Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
  37. Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
  38. Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
  39. Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
  40. Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Amplicon NS NSCLC TAT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved