Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

Summary

يحدد هذا البروتوكول استخدام التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) لدمج الجينات (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للطحالب الدقيقة الخضراء Chlorella vulgaris ، مما يؤدي إلى إنتاج محولات مستقرة.

Abstract

يعمل التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) كأداة مستخدمة على نطاق واسع لمعالجة جينومات النبات. ومع ذلك ، تظهر A. tumefaciens القدرة على نقل الجينات إلى مجموعة متنوعة من الأنواع. تفتقر العديد من أنواع الطحالب الدقيقة إلى طرق راسخة لدمج الجينات ذات الأهمية بشكل موثوق في جينومها النووي. لتسخير الفوائد المحتملة للتكنولوجيا الحيوية للطحالب الدقيقة ، تعد أدوات معالجة الجينوم البسيطة والفعالة أمرا بالغ الأهمية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول AMT محسن لأنواع الطحالب الدقيقة الصناعية Chlorella vulgaris ، باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر المراسل (mGFP5) وعلامة مقاومة المضادات الحيوية ل Hygromycin B. يتم اختيار الطفرات من خلال الطلاء على وسائط Tris-Acetate-Phosphate (TAP) التي تحتوي على Hygromycin B و cefotaxime. يتم قياس التعبير عن mGFP5 عن طريق التألق بعد أكثر من عشرة أجيال من الزراعة الفرعية ، مما يشير إلى التحول المستقر لكاسيت T-DNA. يسمح هذا البروتوكول بتوليد موثوق به للعديد من مستعمرات C. vulgaris المعدلة وراثيا في أقل من أسبوعين ، باستخدام ناقل التعبير النباتي pCAMBIA1302 المتاح تجاريا.

Introduction

تمتلك Agrobacterium tumefaciens، وهي بكتيريا سالبة الجرام تنقلها التربة، قدرة فريدة على نقل الجينات بين المملكة، مما أكسبها لقب "مهندس وراثي طبيعي^"1. يمكن لهذه البكتيريا نقل الحمض النووي (T-DNA) من البلازميد الذي يحفز الورم (Ti-Plasmid) إلى الخلايا المضيفة من خلال نظام إفراز من النوع الرابع ، مما يؤدي إلى تكامل الحمض النووي التائي والتعبير عنه داخل جينوم المضيف¹،²،^3،4. في البيئة الطبيعية ، تؤدي هذه العملية إلى تكوين الورم في النباتات ، والمعروف باسم مرض المرارة التاجية. ومع ذلك ، يمكن ل Agrobacterium....

Protocol

يجب تعقيم جميع الوسائط والحلول قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع أنابيب الطرد المركزي ، وأطراف الماصة ، وما إلى ذلك ، معقمة أو معقمة قبل الاستخدام. لسهولة الرجوع إليها ، يتم سرد وصفات الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1.

1. تحضير خلايا A. tumefaciens ذات الكفاءة الكهربائية

1. تلقيح Agrobacterium (AGL-1) في دورق شاكر معقم سعة 25 مل من وسائط LB (مكمل بالريفامبيسين ، 20 مجم / لتر -1) من مخزون الجلسرين المجمد وينمو طوال الليل عند ^28-30 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: سلالة Agrobacterium AGL-1 (انظر جدول المواد

النتائج

لإظهار التحول الناجح باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه ، تم استزراع C. vulgaris إما مع AGL-1 الذي يحتوي على بلازميد pCAMBIA1302 أو بدون البلازميد (من النوع البري ومطلي على أجار TAP المكمل ب Hygromycin B و cefotaxime (الشكل 1 أ). تظهر اللوحة الموجودة في أقصى اليسار المستعمرات المحولة القادرة على ا?.......

Discussion

ترتبط كفاءة التحول بعدة معايير مختلفة. يعد اختيار سلالات A. tumefaciens المستخدمة في AMT أمرا بالغ الأهمية. AGL-1 هي واحدة من أكثر السلالات الغازية المكتشفة ، ولهذا السبب ، تم استخدامها بشكل روتيني في نبات AMT. يعد استكمال وسائط الحث بالجلوكوز (15-20 مللي مول) مهما أيضا لكفاءة AMT. بالنظر إلى أن C. vulga.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01