A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحقيق التصنيع على نطاق واسع للخلايا الملتصقة من خلال نظام مغلق تماما يعتمد على ناقلات دقيقة قابلة للذوبان من فئة GMP. تم التحقق من صحة زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية والخلايا HEK293T وخلايا Vero وتلبية متطلبات الكمية ومعايير الجودة لصناعة العلاج بالخلايا والجينات.

Abstract

واجه الباحثون في صناعة العلاج بالخلايا والجينات (CGT) منذ فترة طويلة تحديا هائلا في التوسع الفعال والواسع النطاق للخلايا. لمعالجة أوجه القصور الأساسية في نظام الاستزراع المستوي ثنائي الأبعاد (2D) ، قمنا بتطوير منصة إنتاج خلايا آلية مغلقة النطاق الصناعي (ACISCP) تعتمد على ناقل دقيق من الدرجة GMP وقابل للذوبان ومسامي لثقافة 3D للخلايا الملتصقة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية / اللحمة المتوسطة البشرية (hMSCs) وخلايا HEK293T وخلايا Vero. لتحقيق توسع واسع النطاق ، تم إجراء توسع على مرحلتين مع مفاعلات حيوية ذات خزان تحريك 5 لتر و 15 لتر لإنتاج 1.1 × 1010 hMSCs مع توسع إجمالي 128 ضعفا في غضون 9 أيام. تم حصاد الخلايا عن طريق إذابة الناقلات الدقيقة تماما ، وتركيزها وغسلها وصياغتها باستخدام نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي المستمر التدفق ، ثم تم اقتباسها بنظام ملء الخلايا. بالمقارنة مع الثقافة المستوية 2D ، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في جودة hMSCs التي يتم حصادها من ثقافة 3D. لقد قمنا أيضا بتطبيق هذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان على أنواع الخلايا الشائعة الأخرى في قطاع CGT. على وجه التحديد ، تمت زراعة خلايا HEK293T وخلايا Vero لذروة كثافة الخلايا 1.68 × 107 خلايا / مل و 1.08 × 107 خلايا / مل ، على التوالي. توفر هذه الدراسة بروتوكولا لاستخدام منصة هندسة العمليات الحيوية التي تسخر خصائص الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان من فئة GMP والمعدات المغلقة المتقدمة لتحقيق التصنيع على نطاق صناعي للخلايا الملتصقة.

Introduction

شهدت صناعة CGT توسعا هائلا على مدار العقدين الماضيين. من المتوقع أن يؤدي تطور أدوية الجيل التالي إلى علاج وعلاج العديد من الأمراض المقاومةللحرارة 1. منذ أول موافقة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) على منتج CGT ، Kymriah ، في عام 2017 ، استمر البحث والتطوير المتعلق ب CGT في العالم في النمو بمعدل سريع ، حيث شهدت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية زيادة تطبيقات الأدوية الجديدة التجريبية النشطة ل CGT إلى 500 في 20182. كان من المتوقع أن يكون عدد الموافقات على منتجات CGT على الأرجح 54-74 في الولايات المتحدة بحلول عام 20302.

في حين أن النمو السريع في أبحاث CGT والابتكار مثير ، لا تزا....

Protocol

تم الحصول على الحبل السري البشري من مستشفى بكين تسينغهوا تشانغينغ. تم إجراء جميع الإجراءات والبروتوكولات المتعلقة باكتساب وعزل وزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري (UCMSCs) بموافقة مستنيرة وبموافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين تسينغهوا تشانغينغ (رقم الإيداع 22035-4-02) ، وامتثلت الإجراءات والبروتوكولات لإعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة.

1. ثقافة أحادية الطبقة من hMSCs وخلايا HEK293T وخلايا Vero

  1. عزل UCMSCs البشرية الأولية من هلام وارتون وفقا للطريقةالمبلغ عنها 21. استخدم وسط استزراع hMSC الخالي من المصل (SF) لعزل ونمو UCMSCs الأولية ، وحص....

النتائج

منصة ACISCP عبارة عن نظام مغلق بالكامل يستخدم سلسلة من المفاعلات الحيوية ذات الخزانات المقلوبة لتوسيع النطاق ، ونظام معالجة الخلايا لحصاد الخلايا وتركيبها آليا ، ونظام ملء الخلايا (الشكل 1). تلتصق الخلايا الملتصقة بالناقلات الدقيقة المسامية ، والتي يمكن تشتيتها في المفاعل ا?.......

Discussion

يستخدم كل من العلاج المناعي والعلاج بالخلايا الجذعية الخلايا الحية كأدوية. ومع ذلك ، لا ينبغي تنقية منتجاتها النهائية أو تعقيمها بنفس طريقة الجزيئات الصغيرة أو الفيروسات. لذلك ، يجب دائما مراعاة مبدأ الجودة حسب التصميم (QbD) وتطبيقه عمليا على عملية التصنيع والتحكم الكيميائي (CMC) أثناء إنتاج.......

Disclosures

Y.D. هو مستشار علمي ، و H.X. ، Y.Z. ، L.G. ، M.L. ، Y.Y. ، W.L. ، و X.Y. موظفون في شركة Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. ليس للمؤلفين الآخرين أي مصلحة تجارية أو ملكية أو مالية في المنتجات أو الشركات الموضحة في هذه المقالة. يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (82125018).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin EDTABasalMediaS310JVUsed for 2D cell harvest.
3D FloTrix DigestCytoNiche BiotechR001-500This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free MediumCytoNiche BiotechRMZ112This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration ModuleCytoNiche BiotechR020-00-10This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)CytoNiche BiotechR020-00-03Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)CytoNiche BiotechR020-00-01Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)CytoNiche BiotechR020-00-04Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable KitCytoNiche BiotechPACK-01-01This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cellsCytoNiche BiotechvivaPACKThis system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing systemCytoNiche BiotechvivaPREP PLUSThis system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing KitCytoNiche BiotechPREP-PLUS-00This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 LCytoNiche BiotechFTVS15This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 LCytoNiche BiotechFTVS05This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)CytoNiche BiotechR020-10-10This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)CytoNiche BiotechR020-05-10This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02CytoNiche BiotechG02-10-10gThese porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01CytoNiche BiotechV01-100-10gThese porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01CytoNiche BiotechW01-10-10g (single-use packaging);
W01-200 (tablets)
These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 AntibodyBioLegend368512Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining KitDojindoC542Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)Saint-GobainCAP-38Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)Saint-Gobain374-250-3Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50Miltenyi Biotec 200-074-400Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO) SigmaD2650-100mLUsed for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)BasalMediaL120KJUsed for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)DWK life sciences218016357Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)DWK life sciences218017353Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)DWK life sciences218014459Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)Saint-GobainEZ500 ML-38-2Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior qualityWisent086-150Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 AntibodyBioLegend301804Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 AntibodyBioLegend343504Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) AntibodyBioLegend328108Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometryBeckman CoulterCytoFLEXUsed for cell identity assessment.
Fluorescence Cell AnalyzerAlit life scienceCountstar Rigel S2Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports DWK life sciences292632806Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose MeterSinocare6243578Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesiumGibco14025092Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)CSL BehringN/AUsed for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscopeOLYMBUSCKX53SFUsed for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)Thermo Scientific3662-0500PKUsed for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfineMINHAI BIOSC101.02Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kitCyagenHUXUC-90031Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kitCyagenHUXUC-90041Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kitCyagenHUXUC-90021Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 AntibodyBioLegend800504Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 AntibodyBioLegend302208Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) AntibodyBioLegend344004Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR AntibodyBioLegend307605Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)Wisent311-010-CLUsed in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)Saint-GobainULTRA-C-125-2FUsed for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile SalineHopebiolHBPP008-500Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant TrypsinBasalMediaS342JVThis reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube SealerYingqi BiotechTube Sealer IThis sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubingChu BiotechTube Welder Micro IUsed for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubingYingqi BiotechTube Welder I-V2Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability StainsNexcelomCS2-0106-25mLDual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.

References

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GMP 3D HMSCs HEK293T Vero ACISCP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved