مورين هند نموذج زرع الأطراف لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام وتر العرقوب

Summary

نقدم منصة تجريبية مخصصة وبروتوكول زراعة الأنسجة الذي يعيد إنشاء التغيير الغضروفي الليفي المدفوع بتأثير إدخال وتر العرقوب في نباتات الأطراف الخلفية للفأر مع بقاء الخلية المستدامة ، مما يوفر نموذجا مناسبا لاستكشاف البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام الأوتار.

Abstract

يؤدي اصطدام الأوتار بالعظام إلى توليد بيئة إجهاد ميكانيكية متعددة المحاور مع إجهاد ضاغط عرضي مرتفع بشكل ملحوظ ، مما يثير نمطا ظاهريا لغضروفا ليفيا موضعيا يتميز بتراكم المصفوفة الغنية بالجليكوزامينوجليكان (GAG) وإعادة تشكيل شبكة الكولاجين. في حين أن الغضروف الليفي هو سمة طبيعية في المناطق المصابة من الأوتار السليمة ، فإن ترسب GAG الزائد وعدم تنظيم شبكة الكولاجين هي السمات المميزة لاعتلال الأوتار. وفقا لذلك ، يتم التعرف سريريا على الاصطدام كعامل خارجي مهم في بدء وتطور اعتلال الأوتار. ومع ذلك ، فإن البيولوجيا الميكانيكية الكامنة وراء اصطدام الأوتار لا تزال قيد الدراسة. أدت الجهود السابقة لتوضيح الاستجابة الخلوية لاصطدام الأوتار إلى تطبيق ضغط أحادي المحور على الخلايا واستئصال الأوتار في المختبر. ومع ذلك ، تفتقر الخلايا المعزولة إلى بيئة خارج الخلية ثلاثية الأبعاد حاسمة للاستجابة الميكانيكية ، وتفشل كل من الدراسات في المختبر والدراسات المختبرية المستأصلة في تلخيص بيئة الإجهاد متعدد المحاور الناتجة عن اصطدام الأوتار في الجسم الحي ، والذي يعتمد على السمات التشريحية للمنطقة الاصطدامية. علاوة على ذلك ، في الجسم الحي ، تفتقر نماذج اصطدام الأوتار إلى السيطرة على بيئة الإجهاد الميكانيكي. للتغلب على هذه القيود ، نقدم نموذجا جديدا لزرع الأطراف الخلفية للفأر مناسبا لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام وتر العرقوب. يحافظ هذا النموذج على وتر العرقوب في الموقع للحفاظ على التشريح المحلي ويعيد إنتاج بيئة الإجهاد متعددة المحاور الناتجة عن اصطدام إدخال وتر العرقوب على العقبي أثناء الانثناء الظهري للكاحل المطبق بشكل سلبي مع الاحتفاظ بالخلايا داخل بيئتها الأصلية. نحن نصف بروتوكول زراعة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من هذا النموذج ونقدم البيانات التي تثبت استمرارية النبات المستدام على مدار 7 أيام. تظهر النتائج التمثيلية تلطيخا محسنا نسيجيا وانخفاضا في محاذاة ألياف الكولاجين الثانوية للاصطدام ، مما يشير إلى ارتفاع تكوين الغضروف الليفي. يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة للتحقيق في أنظمة التحميل الميكانيكية المختلفة ويسمح بمعالجة المسارات الجزيئية ذات الأهمية لتحديد الآليات التي تتوسط تغيير النمط الظاهري في وتر العرقوب استجابة للاصطدام.

Introduction

تعاني العديد من الأوتار ، بما في ذلك وتر العرقوب وأوتار الكفة المدورة ، من اصطدام عظمي بسبب الوضع التشريحي الطبيعي^1,2,3,4. يؤدي اصطدام الأوتار إلى توليد إجهاد ضاغط موجه بشكل عرضي إلى محور الألياف الطولي^5,6,7. تظهر مناطق اصطدام الأوتار نمطا ظاهريا فريدا للغضروف الليفي يتم فيه تضمين الخلايا المستديرة المنكمشة (الخلايا الليفية الغضروفية) داخل شبكة كولاجين غير منظمة مع زيادة ملحوظة في محتوى الجليكوزامينوجليكان (GAG)^2,<....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة الموارد الحيوانية بجامعة روتشستر.

1. إعداد وسائط زراعة الأنسجة

1. استزراع جميع النباتات في وسط النسر المعدل من Dulbecco (1x DMEM) مع 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين و 200 ميكرومتر حمض الأسكوربيك L في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. بالنسبة للمعالجة الأولية لمدة 48 ساعة ، استزرع كل نبات في 70 مل من وسائط الاستزراع مع 100 نانومتر ديكساميثازون⁷⁴. بعد المعالجة المسبقة ، أطراف الثقافة لمدة 7 أيام أخرى دون ديكساميثازون ، وتغيير الوسائط كل 48-72 ساعة.
   ملاحظة: لا ينصح بإضافة المصل ، مثل مصل الأبقار الجنيني ، إلى وسائط الاستزراع بما....

النتائج

تظهر الصور التمثيلية لأقسام الأنسجة الملطخة TUNEL الحد الأدنى من نوى موت الخلايا المبرمج داخل جسم وتر العرقوب بعد 7 أيام من زراعة النباتات عبر المجموعات التجريبية (الشكل 2 أ). يوفر القياس الكمي لهذه الصور دليلا على أن بروتوكول زراعة الأنسجة يحافظ على ما يصل إلى 78٪ من الصلاحية ?.......

Discussion

توفر منصة زرع الأطراف الخلفية التجريبية للفأر المقترنة ببروتوكول زراعة الأنسجة الموصوف في هذه الدراسة نموذجا مناسبا لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لتشكيل الغضروف الليفي الناجم عن الاصطدام عند إدخال وتر العرقوب. تتجلى فائدة هذا النموذج الخارجي من خلال النتائج التمثيلية ، والتي تشير إلى .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	-	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining