JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للحث على ارتفاع ضغط الدم من النوع H وتقييم الآثار الخافضة للضغط من Huotan Jiedu Tongluo ديكوتيون (HTJDTLD) تدار داخل المعدة. في الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم من النوع H ، كان ل HTJDTLD تأثيرات فعالة خافضة للضغط ، ربما ترتبط بتثبيط تنشيط مسار موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإجهاد (ER).

Abstract

أصبح ارتفاع ضغط الدم من النوع H ، وهو شكل محدد من ارتفاع ضغط الدم يتميز بارتفاع مستويات الحمض الاميني في البلازما (Hcy) ، تحديا كبيرا للصحة العامة في جميع أنحاء العالم. بحثت هذه الدراسة في التأثيرات الخافضة للضغط والآليات الأساسية ل Huotan Jiedu Tongluo decoction (HTJDTLD) ، وهي تركيبة طبية صينية تقليدية فعالة للغاية تستخدم عادة لعلاج تضيق الأوعية الدموية. تم استخدام الميثيونين للحث على ارتفاع ضغط الدم من النوع H في الفئران ، وتم إعطاء HTJDTLD داخل المعدة. بعد ذلك ، تم قياس ضغط الدم الانقباضي والانبساطي للشريان الذيلي للفئران بواسطة قياس الضغط الذيلي غير الباضع للفئران. تم إجراء التقييم النسيجي للشريان الأورطي عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE). تم استخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لقياس مستويات Hcy ، وتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) والنشاف الغربي لتحديد مستويات mRNA والبروتين للبروتين التنظيمي للجلوكوز 78 (GRP78) ، عامل نخر الورم (TNF) العامل المرتبط بمستقبلات 2 (TRAF2) ، كينازات c-Jun N-terminal (JNK) ، و caspase-3. أظهرت النتائج أن HTJDTLD خفض ضغط الدم بشكل كبير ، وخفف من الآفات النسيجية المرضية ، وخفض مستويات Hcy بعد العلاج بالميثيونين. علاوة على ذلك ، يثبط HTJDTLD بشكل كبير التعبير الجيني والبروتيني ل GRP78 و JNK و TRAF2 و caspase 3 ، والتي تشارك بشكل رئيسي في مسار موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإجهاد في الشبكة الإندوبلازمية (ER). بشكل عام ، أشارت النتائج إلى أن HTJDTLD كان له تأثيرات فعالة خافضة للضغط في الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم من النوع H وكشفت عن الآليات الخافضة للضغط المرتبطة بتثبيط تنشيط مسار موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإجهاد ER.

Introduction

أصبح ارتفاع ضغط الدم ، وهو عامل خطر رئيسي للنوبات القلبية والسكتة الدماغية والفشل الكلوي ، تحديا كبيرا للصحة العامة يؤثر على مليار شخص في جميع أنحاءالعالم 1. الهوموسيستين (Hcy) ، وهو حمض أميني يحتوي على مجموعة ثيول ، هو وسيط استقلابي حيوي لاستقلاب الميثيونين. يتم تعريف ارتفاع ضغط الدم مع ارتفاع مستويات Hcy في البلازما على أنه ارتفاع ضغط الدم من النوع H ، والذي يمكن أن يكون عامل خطر كبير لحدوث وتكرار أمراض القلب والأوعية الدموية الدماغية مثل السكتة الدماغية 2,3. أفادت الدراسات الحديثة أن الإقامة المشتركة لارتفاع ضغط الدم من النوع H يمكن أن تؤدي إلى تفاقم الآثار الجانبية للأمراض القلبية الوعائية والدماغية4. والجدير بالذكر أن 75٪ من المرضى في الصين الذين يعانون من ارتفاع ضغط الدم من النوع H يعانون من ارتفاع ضغط الدم الأساسي ، مما يؤثر بشكل خطير على نوعية الحياة5. في الوقت الحاضر ، يشمل علاج ارتفاع ضغط الدم من النوع H بشكل رئيسي الطب الغربي. ومع ذلك ، قد يسبب بعض الآثار الضارة وضعف الامتثال ولم يعد بإمكانه تلبية احتياجات الإدارة الشاملة لارتفاع ضغط الدم من النوع H.

الطب الصيني التقليدي (TCM) هو مورد فريد له تاريخ يزيد عن 2000 عام في الصين. نظرا للحاجة غير الملباة للسيطرة على ارتفاع ضغط الدم في الطب الغربي ، بدأ الأطباء في النظر في الدور المحتمل للطب الصيني التقليدي في الوقاية والعلاج من ارتفاع ضغط الدم من النوعH 6. Huotan Jiedu Tongluo Decoction (HTJDTLD) هي صيغة الطب الصيني التقليدي التي صاغها البروفيسور يو دينغ ، مستمدا من خبرته السريرية الواسعة7. على مدار أكثر من 20 عاما من التطبيق السريري ، أظهر HTJDTLD فعالية ملحوظة في علاج أمراض القلب والأوعية الدموية والدماغية1. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عما إذا كان HTJDTLD له آثار علاجية في ارتفاع ضغط الدم من النوع H. لذلك ، كنا نهدف إلى استكشاف التأثيرات الخافضة للضغط والآليات المحددة ل HTJDTLD في الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم من النوع H وتحديد الأدوية العلاجية المحتملة لعلاج ارتفاع ضغط الدم من النوع H.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة تشانغتشون للطب الصيني. يتم سرد المواد في جدول المواد.

1. والعلاج

  1. قسم عشوائيا ما مجموعه 50 فأرا بالغا مصابا بارتفاع ضغط الدم تلقائيا (SHRs) (ذكر ، يبلغ من العمر 50 يوما) إلى خمس مجموعات ، بما في ذلك المجموعة الضابطة (CON) والميثيونين (MET) و MET + HTJDTLD + Enalapril maleate (EM) و MET + EM ومجموعات MET + HTJDTLD.
    ملاحظة: تم إيواء فئران التجارب في بيئة خاضعة للرقابة مصممة لضمان راحتهم ورفاهيتهم. يتميز المرفق بغرف يتم التحكم في درجة حرارتها عند 22 درجة مئوية ثابتة ، مع رطوبة نسبية تتراوح بين 40 و 60٪. كانت أقفاص الإسكان مصنوعة من البولي كربونات الشفاف ، مما يوفر مساحة واسعة لكل فأر للتحرك بحرية. اتبع جدول الإضاءة دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة ، تحاكي ظروف ضوء النهار الطبيعية. تم تزويد الفئران بالغذاء والماء الكافيين.
  2. تزويد الفئران بالنظام الغذائي التالي لمدة 28 يوما.
    1. أعط الفئران في مجموعة MET نظاما غذائيا ميثيونين بنسبة 3٪ لمدة 28 يوما للحث على ارتفاع ضغط الدم من النوع H.
    2. تطبيق الفئران في مجموعة MET + HTJDTLD + EM داخل المعدة مع HTJDTLD (1.633 جم / مل) و EM (0.2 مجم / مل) بجرعة 1 مل / كجم عند الفئران بالإضافة إلى حمية الميثيونين 3٪.
    3. إدارة الفئران في مجموعات MET + EM و MET + HTJDTLD مع HTJDTLD أو EM عن طريق التزويج ، على التوالي ، إلى جانب حمية الميثيونين 3٪.
      ملاحظة: يتكون HTJDTLD من Fructus Trichosanthis (20 جم) ، Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 جم) ، Lonicerae japonicae flos (30 جم) ، Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 جم) ، Radix Angelicae sinensis (15 جم) ، Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 جم) ، Hirudo (5 جم) ، Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 جم) ، و Radix Scrophulariae (15 جم) ، وتم تفكيكه كما تم الإبلاغ عنه سابقا7. EM المذاب في الماء النقي (0.2 ملغ / مل) بمثابة عنصر تحكم إيجابي.

2. قياس ضغط الدم

ملاحظة: يتم إجراء قياسات ضغط الدم باستخدام مقياس ضغط الدم غير الباضع (جدول المواد).

  1. بعد العلاج لمدة 28 يوما ، قم بصيام الفئران في كل مجموعة لمدة 12 ساعة وقياس ضغط الدم.
  2. اختر جهاز تقييد يتناسب مع حجم الفئران. يتكون جهاز التقييد المستخدم في هذه الدراسة من شبكة تقييد أسطوانية ، وغطاء قماش ، وأنبوب حراري ، ووسادة رغوة مثبتة. ضع الجرذ في شبكة ضبط النفس ، ضع شبكة التقييد في الأنبوب الحراري ، ثم ضع الأنبوب الحراري في غطاء القماش.
  3. ضع كابل الإشارة في وضع مناسب أسفل الغطاء. ضع ذيل الجرذ في الفجوة المتوفرة في الغطاء وقم بتثبيته على وسادة شكل التثبيت. يفضل وجود بيئة غير مشغولة وهادئة ودافئة للقياسات. انقل الفئران إلى موقع القياس قبل 20-30 دقيقة حتى تتمكن الفئران من التكيف مع بيئة القياس.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات 2.2-2.3 عدة مرات لتثبيت الفئران. بعد عدة جلسات تدريبية ، سوف تعتاد الفئران على ذلك ويمكن أن تستقر بسرعة كبيرة ، وهو مناسب لقياس ضغط الدم اللاحق.
  4. قم بتوصيل وصلة خرطوم الهواء للمستشعر المضغوط ووصلة الإشارة وأنبوب التثبيت. ضع مستشعر الضغط عند طرف الذيل.
  5. قياس ضغط الدم. تظهر موجة نبضية بعد إدخال ذيل الفئران في المستشعر. اضغط على بدء / إيقاف لبدء / إيقاف القياس.
    ملاحظة: سيحدد الجهاز تلقائيا ما إذا كان ذيل الجرذ قد تم إدخاله في المستشعر. عندما لا يتم إدخال ذيل الجرذ ، لن يبدأ مستشعر الضغط في الضغط ولن يقوم بالقياس.
  6. عند اكتمال اختبار ضغط الدم ، ستظهر قائمة النتائج تلقائيا. تحقق من متوسط قيمة القياس والانحراف المعياري (SD) والخطأ المعياري (SE) ومعامل الاختلاف (CV) في قائمة النتائج .
    ملاحظة: تم قياس ضغط الدم لكل فأر ثلاث مرات ، مع فاصل زمني يزيد عن 2 دقيقة ، وتم حساب القيمة المتوسطة.
  7. بعد قياس ضغط الدم ، القتل الرحيم للفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم الزائد 2 ٪ (100 ملغ / كغ). ثم ، باستخدام المقص الجراحي والملقط المسنن ، قم بتشريح طبقة الفئران بطبقة من العجان إلى الرقبة. اقلب محتويات الصدر والبطن ، وانتقل إلى تشعب الأبهر البطني بين الكليتين ، واجمع الشريان الأورطي حتى جزء من قوس الأبهر.

3. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE)

  1. إصلاح الأنسجة الوعائية الأبهري في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة على الأقل.
  2. خذ عينات الأوعية الدموية ، وقم بتجفيفها في كحول متدرج ، واجعلها شفافة في الزيلين ، وقم بتضمينها في البارافين.
  3. بعد التضمين ، اصنع شرائح مستمرة بسمك 3-5 مم. جفف الشرائح على حرارة 60-70 درجة مئوية ، ثم خزنها في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. قم بإزالة الشمع من المقاطع عن طريق غمر الأقسام في الزيلين I لمدة 30 دقيقة ، والزيلين II لمدة 30 دقيقة ، والكحول 100٪ I لمدة 10 دقائق ، والكحول 100٪ II لمدة 10 دقائق ، والكحول 95٪ I لمدة 5 دقائق ، والكحول 95٪ II لمدة 5 دقائق ، والكحول بنسبة 80٪ لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفه بالماء المقطر.
  5. تلطيخ الأجزاء في هاريس الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ، وشطف في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق. التفريق في 1 ٪ من الكحول حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 ثوان ، وشطف جيدا في ماء الصنبور لمدة 15 دقيقة. اغسل القسم بماء الأمونيا لمدة 5 ثوان ، واشطفه جيدا في ماء الصنبور لمدة 15 دقيقة.
  6. قم بإجراء المراقبة المجهرية ، وصمة عار باستخدام eosin لمدة 10 دقائق ، وشطف جيدا في ماء الصنبور لمدة 15 دقيقة.
  7. قم بتجفيف الأقسام عن طريق غمرها في 80٪ كحول إيثيلي لمدة 10 ثوان ، و 95٪ كحول I لمدة 5 دقائق ، و 95٪ كحول II لمدة 5 دقائق ، و 100٪ كحول I لمدة 10 دقائق ، وكحول 100٪ II لمدة 10 دقائق ، وزيلين I لمدة 10 دقائق ، وزيلين II لمدة 10 دقائق.
  8. ختم الأقسام باستخدام اللثة المحايدة.
  9. مراقبة التغيرات النسيجية في أنسجة الشريان الأورطي تحت المجهر الضوئي (هدف 100x ، تكبير 1000x).

4. تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان

  1. قم بإزالة الشمع الروتينية على غرار تلطيخ HE.
  2. تلطيخ الهيماتوكسيلين: اغمر الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق ، ثم اشطفها بماء الصنبور على الفور.
  3. اغمر الشرائح في محلول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لبضع ثوان ، ثم اشطفها بماء الصنبور بعد ذلك مباشرة.
  4. اغمر الشرائح في بقعة ليختنشتاين الأرجواني الحمضية لمدة 5 دقائق ثم اشطفها بالماء.
  5. اغمر الشرائح في 1٪ حمض فوسفوموليبديك لمدة 5 دقائق.
  6. اغمر الشرائح في 2٪ تلطيخ أزرق من الأنيلين لمدة 5 دقائق ومحلول غسيل غمر حمض الخليك الجليدي بنسبة 1٪ لمدة دقيقة واحدة. ثم ، قم بإسقاط الشرائح بسرعة في 95٪ كحول 3 مرات.
  7. قم بإجراء الجفاف الروتيني والشفافية وختم اللثة المحايد على غرار تلطيخ HE.

5. قياس Hcy بواسطة ELISA

  1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2٪ بنتوباربيتال الصوديوم (45 ملغ / كغ) وتأكيد عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم. امسك الفئران وقطع الشعيرات لتجنب الاتصال عند أخذ الدم. إزالة مقل العيون من الفئران مع ملقط منحني وجمع الدم في أنابيب الطرد المركزي microcentrige معقمة المعدة. وبعد ذلك ، القتل الرحيم للفأر بحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم الزائد بنسبة 2٪ (100 مجم / كجم).
  2. اترك الدم يتخثر بشكل طبيعي لمدة 10-20 دقيقة في RT ، ثم أجهزة الطرد المركزي (626-1409 × جم) الدم لمدة 20 دقيقة عند 2-8 درجة مئوية.
  3. اجمع المادة الطافية بعناية واحفظها في الثلاجة عند -80 درجة مئوية.
  4. قم بتخفيف المعيار في أنبوب الاختبار وفقا لتعليمات المجموعة.
  5. قم بإعداد آبار فارغة (لا يتم إضافة عينات وكواشف إنزيم إلى آبار التحكم الفارغة ؛ بقية الخطوات هي نفسها) ، والآبار القياسية ، وآبار العينات المراد اختبارها. أضف 50 ميكرولتر من المعايير إلى اللوحة ، و 40 ميكرولتر من محلول تخفيف العينة في آبار العينة ، ثم 10 ميكرولتر من المصل (التخفيف النهائي للعينة هو 5 مرات).
    ملاحظة: أضف العينة إلى قاع آبار اللوحة ؛ حاول ألا تلمس جدران الآبار ، واهتز بلطف لتختلط.
  6. أغلق اللوحة بغشاء مانع للتسرب واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. تمييع محلول الغسيل المركز 30 مرة 30 مرة بالماء المقطر والاستعداد للاستخدام.
  8. قم بإزالة فيلم الختم بعناية ، وتخلص من السائل ، ورجه لإزالة كل السائل. املأ كل بئر بمحلول الغسيل واتركه لمدة 30 ثانية وتخلص منه. كرر هذا 5 مرات واضغط عليه حتى يجف.
  9. أضف 50 ميكرولتر من كاشف الإنزيم إلى كل بئر ، باستثناء الآبار الفارغة.
  10. استخدم طبقة مانعة للتسرب لإغلاق اللوحة ثم احتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. كرر الخطوة 5.8.
  12. أضف 50 ميكرولتر من مطور الألوان A إلى كل بئر ، ثم أضف 50 ميكرولتر من مطور الألوان B ، ورج برفق حتى تمتزج جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تحت الإضاءة المنخفضة.
  13. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر لإنهاء التفاعل (سيتحول اللون الأزرق إلى اللون الأصفر).
  14. صفر التفاعل مع الآبار الفارغة وقياس الامتصاص (قيمة OD) لكل بئر بالتتابع عند 450 نانومتر.
    ملاحظة: يجب إجراء القياس في غضون 15 دقيقة بعد إضافة محلول الإيقاف.

6. استخراج الحمض النووي الريبي والكمية RT-PCR

  1. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي.
    1. قطع أنسجة الأبهر الطازجة بسرعة إلى الحجم المناسب (30-50 ملغ / قطعة) ، وطحنها جيدا في النيتروجين السائل. أضف 1 مل من كاشف Trizol ، واخلطه جيدا ، واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق لتحلل الأنسجة.
    2. أجهزة الطرد المركزي عند 2250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل بعناية طاف إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد دون بيليه.
    3. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم ، ورج بقوة لمدة 15 ثانية ، واحتضن في RT لمدة 5 دقائق.
    4. جهاز طرد مركزي عند 2250 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سيقسم الخليط إلى ثلاث طبقات: الطور العضوي للفينول والكلوروفورم السفلي، والمرحلة الوسطى، والمرحلة المائية العليا.
    5. انقل بعناية المرحلة المائية العليا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد (حوالي 60٪ حجم تريزول). لا تستنشق المرحلة المتوسطة. يمكن ترك كمية صغيرة من السائل العلوي.
    6. أضف كمية متساوية من الأيزوبروبانول ، واخلطها برفق عن طريق التقليب حوالي 10 مرات ، واتركها لمدة 10 دقائق في RT.
    7. أجهزة الطرد المركزي عند 2250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسل راسب الحمض النووي الريبي مرتين ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪.
    8. أجهزة الطرد المركزي عند 2250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وجففها بالهواء في RT لمدة 5-10 دقائق.
    9. قم بإذابة الحمض النووي الريبي في 15-50 ميكرولتر من ماء ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) وتحقق من تركيز الحمض النووي الريبي.
  2. إجراء النسخ العكسي و RT-qPCR (الجدول 1)
    1. الكشف عن التعبير الجيني المتعلق بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ERS) وموت الخلايا المبرمج بواسطة qRT-PCR. استخدم إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج في الخطوة 6.1 وقم بنسخه عكسيا إلى cDNA باستخدام مجموعة تخليق cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. تحديد التعبير الجيني باستخدام نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي مع مزيج SYBR Green PCR الرئيسي في حجم تفاعل يبلغ 20 ميكرولتر.
    3. قم بتحليل البيانات كميا بطريقة 2−ΔΔCTوالتعبير عنها كفرق n أضعاف بالنسبة للتعبير عن β-actin. الاشعال موضحة في الجدول 2.

7. النشاف الغربي (WB)

  1. استخراج البروتين الكلي للأنسجة.
    1. ضع كمية صغيرة من كتلة الأنسجة في الجزء الكروي من الخالط 1-2 مل ، وقطع كتلة الأنسجة قدر الإمكان بمقص نظيف.
    2. أضف 400 ميكرولتر (w: v = 1:10) من المخزن المؤقت لتحلل RIPA وقم بالتجانس. ثم ضعه على الجليد. بعد بضع دقائق ، طحن مرة أخرى ووضعها على الجليد. كرر عملية الطحن عدة مرات.
    3. بعد 30 دقيقة من التحلل ، استخدم ماصة لنقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي عند 2250 × جم لمدة 10 دقائق ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
  2. تحديد كمية البروتين.
    1. تمييع معايير البروتين وفقا لتعليمات المجموعة. الحصول على تدرجات المعايير على النحو التالي: 0 و 25 و 125 و 250 و 500 و 1000 و 1500 و 2000 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. خذ 2.5 ميكرولتر من عينة البروتين وقم بتخفيفها إلى 25 ميكرولتر (10 أضعاف) باستخدام مخفف العينة.
    3. خذ صفيحة من 96 بئرا وأضف 20 ميكرولتر من عينة البروتين القياسية (وفقا لتدرج التركيز) والبروتين المستهدف إلى الآبار ، على التوالي بئران لكل عينة بروتين مستهدفة.
    4. قم بإعداد محلول التطوير (جاهز للاستخدام) عن طريق خلط السائل A والسائل B بنسبة 50: 1 ، وإضافة 200 ميكرولتر من محلول التطوير إلى كل بئر.
    5. ضع لوحة 96 بئرا مع عينات مضافة في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. كشف الامتصاص عند 562 نانومتر.
    7. احسب تركيز البروتين المراد قياسه.
      1. خذ تركيز البروتين القياسي باعتباره الإحداثي الرأسي والامتصاص عند 562 نانومتر كإحداثي أفقي لرسم المنحنى القياسي.
      2. احسب تركيز البروتين المستهدف بناء على الصيغة التي تم الحصول عليها من المنحنى القياسي والامتصاص المقاس للبروتين المستهدف.
    8. أضف 180 ميكرولتر من مخزن التحميل إلى 20 ميكرولتر من عينة البروتين في أنبوب طرد مركزي دقيق. ضع أنبوب الطرد المركزي في حمام معدني وقم بتشويهه عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. استخدم البروتين المشوه WB أو قم بتخزينه في -20 درجة مئوية.
  3. أداء المناعي.
    1. تكوين هلام الكهربائي البروتين.
      1. قم بتنظيف وتجفيف الصفيحة الزجاجية المصبوبة بالهلام (1 مم أو 1.5 مم) وثبتها على جهاز صب الجل.
      2. تحضير جل فصل 10٪ وفقا للجدول 3. أضف جل الفصل المكون بين الألواح الزجاجية. أضف محلول الجل ببطء لتجنب إنتاج فقاعات الهواء. ثم أضف كمية مناسبة من الإيثانول اللامائي لتسطيح السطح السائل للفاصل. اتركيه في RT لمدة 20-30 دقيقة حتى يتماسك الجل.
        ملاحظة: كلما زاد الوزن الجزيئي ، انخفض تركيز الغراء ، وفقا للحاجة إلى صياغة تركيزات أخرى من فصل الغراء.
      3. تحضير هلام مركز 5 ٪ وفقا للجدول 3. بعد تصلب هلام الفصل ، اسكب الطبقة العليا من الإيثانول اللامائي ، واملأ الجل المركز ، وأدخل ببطء مشط الهلام الذي يطابق اللوحة الزجاجية (احرص على عدم وجود فقاعات هواء). اتركيه في RT لمدة 20-30 دقيقة حتى يتماسك الجل المركز.
    2. أداء الكهربائي.
      1. تزن 60.5 جم من تريس ، 375 جم من الجلايسين ، و 20 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). يضاف الماء إلى 2 لتر ، ويسخن على حرارة 60 درجة مئوية ، ويحرك المزيج حتى يذوب لتشكيل محلول كهربائي 10x. دع الحل يكون في RT ؛ تمييعه إلى 1x عند استخدامه.
      2. قم بإزالة اللوحة الزجاجية التي تحتوي على غراء من جهاز صب الهلام ، واسحب مشط الغراء لأسفل في تدفق المياه بسرعة موحدة ، وفي نفس الوقت ، قم بتصريف فقاعات الهواء في فتحة أخذ العينات.
      3. إصلاح لوحة الزجاج في خزان الكهربائي ، وإضافة حل الكهربائي 1x تكوين. تأكد من امتلاء الخزان الداخلي وأن الخزان الخارجي نصف الخزان الداخلي.
      4. أضف نفس الكتلة من عينة البروتين و 5 ميكرولتر من العلامة (تستخدم للإشارة إلى حجم البروتين) في بئر إضافة العينة.
      5. قم بتشغيل الجل عند 60 فولت لمدة 20 دقيقة ، ثم عند 100 فولت لمدة 90 دقيقة حتى يعمل مخزن التحميل المؤقت إلى الأسفل.
    3. إجراء نقل الغشاء.
      1. تزن 60 جم من Tris و 288 جم من الجلايسين ، وتضاف الماء إلى 2 لتر. حرك المحلول وحله جيدا لعمل محلول نقل غشاء 10x ، واحتفظ به في RT. تمييع بنسبة 1: 2: 7 (10x محلول عبر الغشاء: الميثانول: الماء) لصنع 1x حل العمل.
        ملاحظة: يجب تحضير المحلول عبر الغشاء مسبقا وتبريده إلى 4 درجات مئوية في الثلاجة.
      2. انقع PVDF في الميثانول لفترة زمنية مناسبة (0.5-1 دقيقة) لتنشيط المجموعات الموجبة الشحنة على الغشاء وتسهيل الارتباط بالبروتينات سالبة الشحنة.
      3. خذ مشبك نقل الغشاء وقم بإصلاحه بعد ترتيب المكونات (السطح الأسود - الإسفنج - ورق الترشيح - هلام الرحلان الكهربائي - غشاء PVDF - ورق الترشيح - الإسفنج - السطح الأبيض بالتسلسل).
        ملاحظة: كن حذرا لتجنب فقاعات الهواء. عندما تكون هناك فقاعات هواء ، استخدم الأسطوانة لطرد فقاعات الهواء.
      4. ضع الجبيرة في خزان نقل الغشاء ، وانتبه إلى اتباع موضع القطب الصحيح ، وضع كيسين من الثلج في الخزان ، واملأه بسائل نقل غشاء 1x. أخيرا ، ضع الخزان عبر الغشاء بالكامل في الجليد.
      5. اضبط شروط نقل الغشاء على 100 فولت لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: يمكن تعديل وقت نقل الغشاء وفقا لحجم البروتين ؛ كلما كان الوزن الجزيئي للبروتين أصغر ، كان وقت نقل الغشاء أقصر.
    4. أداء الحجب.
      1. بالنسبة للبروتينات المفسفرة ، استخدم 5٪ BSA (مذيب TBST) كمحلول مانع. بالنسبة للبروتينات غير المفسفرة ، استخدم 5٪ حليب منزوع الدسم (مذيب TBST) للحجب.
      2. صب محلول الحجب في طبق بحجم مناسب. ضع غشاء PVDF في الطبق ، وتأكد من غمر غشاء PVDF في محلول الحظر. أغلق الطبق واحتضانه في RT لمدة 1 ساعة.
      3. إزالة الغشاء. وفقا لعرض العلامة وحجم كل بروتين مستهدف ، قم بقص الغشاء إلى الحجم المناسب وقم بتسميته بأرقام تسلسلية.
    5. احتضان الجسم المضاد
      1. قم بإزالة محلول الحجب وامتصاص السائل المتبقي بورق الترشيح. ضع PVDF المقطوع المقابل في تخفيفات الأجسام المضادة المقابلة (بما في ذلك CPR78 [1: 1000] و TRAF2 [1: 1000] و p-JNK [1: 1000] و caspase [1: 1000] و GAPDH [1: 1000]) وضعه على شاكر دوار عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      2. أضف 1x TBST واشطفه في RT ثلاث مرات (10 دقائق لكل منهما).
      3. احتضان غشاء PVDF في تخفيفات الأجسام المضادة الثانوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واحتضان في RT لمدة 1 ساعة.
      4. شطف الغشاء عن طريق إضافة 1x TBST في RT ثلاث مرات (10 دقائق لكل منهما).
    6. تطوير غشاء PVDF.
      1. امزج كميات متساوية من السائل A والسائل B في مجموعة محلول الإنارة ، ورجها جيدا ، واستعد للاستخدام.
      2. ضع غشاء PVDF على فيلم التشبث لينتشر ، وأضف عامل الإنارة المحضر بسرعة وبشكل متساو على الغشاء بسرعة وبشكل متساو. احتضان لمدة 3 دقائق في RT ، وتجنب الضوء.
      3. الكشف عن نطاقات البروتين باستخدام كواشف الكشف عن النشاف الغربية المحسنة (ECL).

8. تحليل البيانات

  1. التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± S.D. إجراء التحليل الإحصائي عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام برنامج SPSS 20.0. ضع في اعتبارك الاختلافات ذات الدلالة الإحصائية عندما تكون p < 0.05.

النتائج

كما هو موضح في الجدول 4 والجدول 5 ، كان ضغط الدم الانقباضي (SBP) وضغط الدم الانبساطي (DBP) أكبر بكثير في مجموعة MET من تلك الموجودة في مجموعة CON من 1 إلى 4 أسابيع. بعد علاج HTJDTLD ، كان SBP و DBP للفئران أقل بكثير من تلك الموجودة في مجموعة MET. والجدير بالذكر أن الاستخدام المشترك ل HTJDTLD و EM ك?...

Discussion

ارتفاع ضغط الدم هو واحد من أكثر اضطرابات القلب والأوعية الدموية شيوعا التي تؤثر على ثلث السكان البالغين وتزيد من خطر الإصابة بالسكتة الدماغية وأمراض القلب التاجية وفشل القلب والكلى8. ارتفاع ضغط الدم من النوع H هو نوع خاص من ارتفاع ضغط الدم يشير إلى تزامن ارتفاع ضغط الدم الأساس...

Disclosures

نعلن أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

ودعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في مقاطعة جيلين (رقم. YDZJ202301ZYTS189).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCRYeasen,China11149EScDNA synthesis kit 
Anti-beta-actin antibodyBioss, Chinabs-0061R
Anti-caspase-3 antibodyBioss, Chinabs-0081R
Anti-GPR78 antibodyAbcam, USAab108513
Anti-JNK antibodyAbcam, USAab76572
Anti-p-JNK antibodyBioss, Chinabsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibodyBioss, Chinabs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibodyBioss, Chinabs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system Bio-RadCFX96real-time PCR detection system 
ECL Western Blot SubstratesMerck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tabletsYangzijiang Pharmaceutical Company, China20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus TrichosanthisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
HirudoThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer Beijing Softron Biotechnology companyBP-2010A
Lonicerae Japonicae FlosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
MethionineSigma, USAM9500
Radix Angelicae SinensisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma GlycyrrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma NardostachyosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae CrenulataeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Salviae MiltiorrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix ScrophulariaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, ChinaMM-0293R2
RIPA bufferShanghai Beyotime Biotechnology companyP0013B

References

  1. Noone, C., Dwyer, C. P., Murphy, J., Newell, J., Molloy, G. J. Comparative effectiveness of physical activity interventions and antihypertensive pharmacological interventions in reducing blood pressure in people with hypertension: Protocol for a systematic review and network meta-analysis. Syst Rev. 7 (1), 128 (2018).
  2. Huang, K., Zhang, Z., Huang, S., Jia, Y., Zhang, M., Yun, W. The association between retinal vessel abnormalities and h-type hypertension. BMC Neurol. 21 (1), 6 (2021).
  3. Tan, Y., Nie, F., Wu, G., Guo, F., Wang, Y., Wang, L. Impact of h-type hypertension on intraplaque neovascularization assessed by contrast-enhanced ultrasound. J Atheroscler Thromb. 29 (4), 492-501 (2022).
  4. Towfighi, A., Markovic, D., Ovbiagele, B. Pronounced association of elevated serum homocysteine with stroke in subgroups of individuals: A nationwide study. J Neurol Sci. 298 (1-2), 153-157 (2010).
  5. Zhong, C., et al. High homocysteine and blood pressure related to poor outcome of acute ischemia stroke in Chinese population. Plos One. 9 (9), e107498 (2014).
  6. Hao, P., Jiang, F., Cheng, J., Ma, L., Zhang, Y., Zhao, Y. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: Evidence and potential mechanisms. J Am Coll Cardiol. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  7. Tian, T., et al. Huotan Jiedu Tongluo decoction inhibits balloon-injury-induced carotid artery intimal hyperplasia in the rat through the perk-eif2α-atf4 pathway and autophagy mediation. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536237 (2021).
  8. Simko, F., Pechanova, O. Potential roles of melatonin and chronotherapy among the new trends in hypertension treatment. J Pineal Res. 47 (2), 127-133 (2009).
  9. Li, T., et al. H-type hypertension is a risk factor for cerebral small-vessel disease. BioMed Res Int. 2020, 6498903 (2020).
  10. Rodrigo, R., Passalacqua, W., Araya, J., Orellana, M., Rivera, G. Homocysteine and essential hypertension. J Clin Pharmacol. 43 (12), 1299-1306 (2003).
  11. Lehmann, M., Gottfries, C. G., Regland, B. Identification of cognitive impairment in the elderly: Homocysteine is an early marker. Dement Geriatr Cogn. 10 (1), 12-20 (1999).
  12. dos Santos, E. F., et al. Evidence that folic acid deficiency is a major determinant of hyperhomocysteinemia in Parkinson's disease. Metab Brain Dis. 24 (2), 257-269 (2009).
  13. Zhao, W., Gao, F., Lv, L., Chen, X. The interaction of hypertension and homocysteine increases the risk of mortality among middle-aged and older population in the United States. J Hypertens. 40 (2), 254-263 (2022).
  14. Woo, K. S., et al. Hyperhomocyst(e)inemia is a risk factor for arterial endothelial dysfunction in humans. Circulation. 96 (8), 2542-2544 (1997).
  15. Lu, F., et al. The intervention of enalapril maleate and folic acid tablet on the expressions of the grp78 and chop and vascular remodeling in the vascular smooth muscle cells of h-hypertensive rats with homocysteine. Eur Rev Med Pharmaco. 22 (7), 2160-2168 (2018).
  16. López-García, P., Moreira, D. Selective forces for the origin of the eukaryotic nucleus. BioEssays. 28 (5), 525-533 (2006).
  17. Minamino, T., Komuro, I., Kitakaze, M. Endoplasmic reticulum stress as a therapeutic target in cardiovascular disease. Circ Res. 107 (9), 1071-1082 (2010).
  18. Chen, X., Cubillos-Ruiz, J. R. Endoplasmic reticulum stress signals in the tumour and its microenvironment. Nat Rev Cancer. 21 (2), 71-88 (2021).
  19. Ji, C., Kaplowitz, N. Hyperhomocysteinemia, endoplasmic reticulum stress, and alcoholic liver injury. World J Gastroentero. 10 (12), 1699-1708 (2004).
  20. Zhang, C., et al. Homocysteine induces programmed cell death in human vascular endothelial cells through activation of the unfolded protein response. J Biol Chem. 276 (38), 35867-35874 (2001).
  21. Cunard, R. Endoplasmic reticulum stress, a driver or an innocent bystander in endothelial dysfunction associated with hypertension. Cur Hypertens Rep. 19 (8), 64 (2017).
  22. Casas, C. GRP78 at the centre of the stage in cancer and neuroprotection. Front Neurosci. 11, 177 (2017).
  23. Urano, F., et al. Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinases by transmembrane protein kinase ire1. Science. 287 (5453), 664-666 (2000).
  24. Borghi, A., Verstrepen, L., Beyaert, R. TRAF2 multitasking in tnf receptor-induced signaling to nf-κb, map kinases and cell death. Biochem Pharmacol. 116, 1-10 (2016).
  25. Wen, X. -. R., et al. Butylphthalide suppresses neuronal cells apoptosis and inhibits JNK-caspase3 signaling pathway after brain ischemia /reperfusion in rats. Cell Mol Neurobiol. 36 (7), 1087-1095 (2016).
  26. Jin, M., et al. Serine-threonine protein kinase activation may be an effective target for reducing neuronal apoptosis after spinal cord injury. Neural Regen Res. 10 (11), 1830-1835 (2015).
  27. Xu, F., et al. Estrogen and propofol combination therapy inhibits endoplasmic reticulum stress and remarkably attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury and ogd injury in hippocampus. Biomed Pharmacother. 108, 1596-1606 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

H Huotan Jiedu Tongluo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved