طريقة سلوكية متعددة الاستخدامات للتحقيق في تأثيرات هرمون الغدة الدرقية على وظيفة المخيخ

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لاختبار سلوك متعدد الاستخدامات تم تطويره مؤخرا ، وهو اختبار شعاع السلم. يتميز هذا الاختبار باكتشاف الرنح المخيخي الخفي الناجم عن خلل في عمل هرمون الغدة الدرقية في الجهاز العصبي المركزي مقارنة باختبارات السلوك التقليدية التي تقيم الأداء الحركي.

Abstract

عمل هرمون الغدة الدرقية (TH) ضروري أثناء تطور الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك المخيخ. في حالة نقص TH في الحياة المبكرة مثل قصور الغدة الدرقية الخلقي ، يظهر المرضى اضطرابات عصبية مثل التخلف المعرفي والعجز الحركي. هناك العديد من الدراسات التي تستخدم نماذج الفئران مع نقص TH الخاص بالأنسجة أو الخلايا للتحقيق في دور TH في المخيخ. بالمقارنة مع الفئران الخلقية المعممة قصور الغدة الدرقية ، تظهر الفئران التي تعاني من نقص TH في الخلايا المخيخية ميزات رنح أكثر اعتدالا ودقة ، مما يجعل تقييم الوظيفة الحركية صعبا عند استخدام الاختبارات التقليدية مثل اختبار الروتارد.

نظرا للحاجة إلى أداة بديلة لتقييم الوظيفة الحركية في النماذج الحيوانية ذات الصلة ب TH ، قمنا بتطوير طريقة سلوكية متعددة الاستخدامات تسمى "اختبار شعاع السلم" ، حيث يمكننا تصميم اختبارات السلم المختلفة اعتمادا على شدة الرنح في الفئران النموذجية. استخدمنا الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستقبل TH سلبي سائد على وجه التحديد في خلية Purkinje المخيخية ، وهي خلية عصبية وحيدة في القشرة المخيخية التي تعدل الأداء الحركي. نجح اختبار شعاع السلم الذي تم بناؤه حديثا في اكتشاف ضعف قوي في الأداء الحركي في الفئران المعدلة وراثيا على مستوى أكبر مقارنة باختبار الروتارد. كما تم الكشف عن اضطراب التعلم الحركي في اختبار شعاع السلم ولكن ليس في اختبار الروتارد. يمكن تطبيق البروتوكول مع هذا الجهاز السلوكي الجديد على نماذج حيوانية أخرى قد تظهر نمطا ظاهريا خفيفا للرنح لفحص التغيرات الطفيفة في وظيفة المخيخ.

Introduction

هرمون الغدة الدرقية (TH) لا غنى عنه لنمو الدماغ¹. على وجه الخصوص ، دوره في المخيخ أمر بالغ الأهمية لأن نقص TH في الحياة المبكرة يسبب تطور المخيخ الشاذ ^1,2. على سبيل المثال في قصور الغدة الدرقية الخلقي ، يظهر المرضى سلسلة من التخلف العصبي بما في ذلك العجز المعرفي والحركي³. للكشف عن دور TH في التطور الوظيفي للمخيخ ، حدت بعض الدراسات من نقص TH بطريقة خاصة بالخلايا المخيخية⁴. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الفئران الخلقية المعممة ، حيث تتأثر جميع الأنسجة والخلايا بنقص TH ، فإن هذه النماذج الخاصة بالمخيخ تعرض ترنحا دقيقا لدرجة أن اختبارات السلوك التقليدية ، مثل اختبارات الروتارود والبصمة وشعاع التوازن ، بالكاد تكتشف الاختلافات. وبالتالي ، للتحقيق الكامل في تأثيرات TH على وظيفة المخيخ ، هناك حاجة إلى أداة تقييم جديدة للكشف عن تغيير طفيف في التنسيق الحركي للفئران النموذجية.

اختبار الروتارود هو الأداة الأكثر شيوعا لتقييم التنسيق الحركي ، الذي طوره في الأصل دنهام وميا⁵ وتم تطبيقه لاحقا على نسخة متسارعة بواسطة جونز وروبرتس⁶. يتم تفسير زمن الوصول للسقوط من القضيب الدوار على أنه اختبار للتنسيق الحركي ، كما أن بساطته وإيجازه يجعلانه شائع الاستخدام بين الباحثين السلوكيين الذين يدرسون الوظيفة الحركية⁷. ومع ذلك ، فإن سهولة استخدام هذا الاختبار هي سيف ذو حدين. نظرا لأن القضيب يدور تلقائيا ، يمكن للفئران التشبث بالقضيب الدوار والبقاء عليه دون أن تتحرك. علاوة على ذلك ، قد تنوي الفئران السقوط بدلا من الاستمرار في التوازن على القضيب الدوار. في كلتا الحالتين ، تكون صحة الاختبار وموثوقيته مشكوك فيها لتقييم "التنسيق الحركي الخالص"⁷. بمعنى آخر ، لا يستهدف بدقة وظيفة المخيخ ويتضمن عوامل أخرى مثل قوة العضلات للإمساك.

بدلا من الأدوات التقليدية لتقييم التنسيق الحركي ، نقدم هنا اختبارا سلوكيا جديدا يسمى "اختبار شعاع السلم" ، والذي تم تطويره مؤخرا في مختبرنا. تم تصميم اختبار المشي على السلم الأفقي لتقييم القدرات الحركية المعقدة المتعلقة بالمخيخ: التنبؤ بالتغذية الأمامية وتكامل الحركة⁸. يتكون جهاز الاختبار من أربع قطع من زجاج شبكي مع ثقوب (الشكل 1). تم توصيل الألواح الأربعة بالتوازي بواسطة مسامير وعصي يتم إدخالها في الثقوب الموجودة على الألواح. تم استخدام لوحين خارجيين لتثبيت الجهاز وتم استخدام لوحين داخليين لتصميم أنواع مختلفة من درجات السلم (الشكل 2C). تم تعديل عرض الدرجة اعتمادا على حجم لتقليل حركة للخلف (الشكل 2 ب). كانت المسافة من نقطة البداية إلى الهدف 110 سم. كان الجهاز موجودا على ارتفاع 60 سم فوق المقعد وتم وضع وسادة أمان أسفل الجهاز (الشكل 2 أ). تم وضع الغرفة المظلمة بالقرب من الهدف لتحفيز على التحرك نحو الهدف (الشكل 2 أ).

قمنا بفحص تأثيرات TH على التطور الوظيفي للمخيخ باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستقبلات TH السلبية السائدة (TR) في خلايا Purkinje المخيخية (الفئران Mf-1 / FVB). في كل من اختبارات شعاع الدوار والسلم ، لاحظنا النمط الظاهري الرنحي المخيخي في الفئران Mf-1 / FVB. ومع ذلك ، نجح اختبار شعاع السلم في اكتشاف اختلافات أكثر أهمية من اختبار الروتارود (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم قدرة التعلم الحركي بشكل أكثر شمولا في اختبار شعاع السلم (الشكل 3B ، C). كخلفية خلوية لمثل هذا النمط الظاهري السلوكي ، تم تثبيط تحريض الاكتئاب طويل المدى (LTD) وبدلا من ذلك ، تم تحفيز التقوية طويلة المدى (LTP) بعد التحفيز الاستقرائي LTD في خلايا Mf-1 / FVB Purkinje⁹. LTD ضروري للتنسيق الحركي والتعلم الحركي في المخيخ¹⁰. أبلغت العديد من الدراسات عن عجز حركي وتثبيط LTD في الفئران بالضربة القاضية أو المتحورة للجينات المنظمة الرئيسية في وظيفة المخيخ ، ومع ذلك ، لم تبلغ أي دراسات عن تحريض LTP بعد التحفيز الاستقرائي^{LTD 11,12}. مجتمعة ، قد تكون هذه الظاهرة فريدة من نوعها للفئران Mf-1 / FVB أو الفئران التي تعاني من نقص TH (لوحظت نفس الظاهرة في الفئران التي بدأت في بداية الغدة الدرقية للبالغين) ، مما يشير إلى أن TH ينظم وظيفة المخيخ بشكل مختلف عن البروتينات الرئيسية الأخرى. إذا كان الأمر كذلك ، فمن المعقول أن الفئران ذات تأثير TH غير الطبيعي لا تظهر ترنح المخيخ بنفس الطريقة مثل الفئران النموذجية الأخرى. هذا يؤكد مرة أخرى على الحاجة إلى طريقة محددة لتقييم آثار TH على وظيفة المخيخ. تقدم هذه الورقة بروتوكولا جديدا للتحقيق في تأثيرات TH على وظيفة المخيخ باستخدام اختبار شعاع السلم الذي تم بناؤه حديثا.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول التجارب على في الدراسة الحالية من قبل لجنة رعاية والتجريب بجامعة غونما. تم تنفيذ جميع إجراءات رعاية وعلاج وفقا للقانون الياباني بشأن رعاية وإدارة والمبادئ التوجيهية لإجراء التجارب على بشكل صحيح الصادرة عن مجلس العلوم في اليابان. يمكن العثور على رسم تجميع الجهاز في الشكل 1.

1. إعداد سلم

1. اختبار السلم الأفقي (الشكل 2C على اليسار)
   1. أدخل أعواد الألمنيوم (قطرها 2 مم) في ثقوب على جدران زجاج شبكي.
      ملاحظة: تختلف المسافة الفاصلة وفقا لحجم الجسم اعتمادا على سلالة أو جنس الفأر الذي تم اختباره (انظر الجدول 1).
   2. اضبط عرض درجات السلم عن طريق توسيع أو تضييق مسافة جدران زجاج شبكي.
      ملاحظة: قد يختلف العرض وفقا لحجم الجسم اعتمادا على سلالة أو جنس الماوس الذي تم اختباره (انظر الجدول 1).
2. اختبار السلم المتعرج (الشكل 2C على اليمين)
   1. أدخل أعواد الألمنيوم (قطرها 2 مم) في كل فتحة ثالثة في الاتجاهين الأفقي والرأسي على جدران زجاج شبكي.
      ملاحظة: تختلف المسافة الفاصلة حسب حجم الجسم اعتمادا على سلالة أو جنس الفأر المختبر (انظر الجدول 1).
   2. اضبط عرض درجات السلم عن طريق توسيع أو تضييق مسافة جدران زجاج شبكي.
      ملاحظة: قد يختلف العرض حسب حجم الجسم أو الإجهاد أو جنس الماوس الذي تم اختباره (انظر الجدول 1).
   3. ضع الغرفة المظلمة في الموقع المستهدف.
   4. ضع الوسادة (يمكن أن تكون مصنوعة من كيس بلاستيكي محشو بمواد عازلة) على بعد 30 سم أسفل إعداد السلم من أجل السلامة.

2. التعود (اليوم 0)

ملاحظة: فمن المستحسن أن تأخذ ما لا يقل عن 1 يوم لتعويد الفئران على إعداد سلم.

1. ضع الماوس على حافة السلم (نقطة البداية).
2. باستخدام نفخة الهواء ، شجع الماوس على المضي قدما على درجة السلم.
3. كرر حتى يعتاد الماوس على المشي على درجات السلم.

3. قياس الأداء الحركي

1. ضع الماوس على حافة السلم (نقطة البداية).
2. سجل الوقت اللازم لإكمال عبور السلم وعدد زلات القدم عندما تفشل الفئران في وضع أقدامها أو تنزلق بعد وضعها على أعواد الألمنيوم (انظر الشكل 2 د). إذا أمكن ، قم بتسجيل الفيديو للتحقق من الأخطاء بعد ذلك.
3. بعد فاصل زمني مدته 15 دقيقة ، كرر القياس (4-5 تجارب في اليوم).
4. كرر التجربة لمدة 3-4 أيام لتقييم التعلم الحركي.

4. التحليل

1. احسب متوسط قيمة الوقت وزلات القدم في اليوم.
2. قارن متوسط القيمة بين المجموعات.

النتائج

في اختبار الروتارود ، أظهرت الفئران Mf-1 / FVB انخفاضا كبيرا في زمن الوصول للسقوط من القضيب الدوار على مدار 3 أيام متتالية مقارنة بالفئران البرية ، مما يشير إلى ضعف التنسيق الحركي (الشكل 3 أ). ومع ذلك ، من حيث النتائج داخل المجموعة ، حسنت الفئران Mf-1 / FVB ...

Discussion

اعتمد تصميمنا على الدراسة السابقة التي أجراها ميتز و Whishaw ، اللذان أبلغا عن فائدة "اختبار المشي على درجة السلم"^13,14. لقد صمموا اختبار المشي على درجة السلم لتقييم المشي الماهر وقياس وضع الأطراف الأمامية والخلفية والخطوات والتنسيق بين الأطرا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air puff	DAISO
Aluminum sticks	CAINZ		2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval).
Blutack	Bostik
Plexiglass	CAINZ		110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each
Screws	CAINZ