JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح البروتوكول المقدم في هذه الدراسة فعالية كاشف الفرق cAMP في الموقع في قياس cAMP من خلال طريقتين. تستخدم إحدى الطرق مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا مع خلايا HEK-293. توضح الطريقة الأخرى خلايا HASM الفردية تحت مجهر الفلورسنت.

Abstract

كاشف الفرق cAMP في الموقع (cADDis) هو مستشعر حيوي جديد يسمح بالقياس المستمر لمستويات cAMP في الخلايا الحية. يتم إنشاء المستشعر الحيوي من بروتين فلوري دائري مرتبط بمنطقة المفصلات في Epac2. يؤدي هذا إلى إنشاء مستشعر حيوي فلوروفور واحد يعرض إما زيادة أو نقصان التألق عند ربط cAMP. يوجد المستشعر الحيوي في إصدارات تصاعدية حمراء وخضراء ، بالإضافة إلى إصدارات خضراء هابطة ، والعديد من الإصدارات الحمراء والخضراء التي تستهدف المواقع دون الخلوية. لتوضيح فعالية المستشعر الحيوي ، تم استخدام النسخة الخضراء الهابطة ، والتي تتناقص في التألق عند ربط cAMP. تم عرض بروتوكولين يستخدمان هذا المستشعر: أحدهما يستخدم مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا المتوافق مع الفحص عالي الإنتاجية والآخر يستخدم التصوير أحادي الخلية على مجهر الفلورسنت. على قارئ اللوحة ، تم تحفيز خلايا HEK-293 المزروعة في 96 لوحة جيدة باستخدام 10 ميكرومتر فورسكولين أو 10 نانومتر إيزوبروتيرينول ، مما أدى إلى انخفاض سريع وكبير في التألق في النسخة الخضراء الهابطة. تم استخدام المستشعر الحيوي لقياس مستويات cAMP في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري (HASM) التي تتم مراقبتها تحت مجهر الفلورسنت. أظهر المستشعر الحيوي الأخضر الهابط استجابات مماثلة لمجموعات الخلايا عند تحفيزه باستخدام فورسكولين أو إيزوبروتيرينول. يسمح هذا الفحص أحادي الخلية بتصور موقع المستشعر الحيوي بتكبير 20x و 40x. وبالتالي ، فإن هذا المستشعر الحيوي cAMP حساس ومرن ، مما يسمح بقياس cAMP في الوقت الفعلي في كل من الخلايا الخالدة والأولية ، ومع الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا. هذه السمات تجعل cADDis أداة قيمة لدراسة ديناميكيات إشارات cAMP في الخلايا الحية.

Introduction

الأدينوزين 3 ′ ، 5 ′ أحادي الفوسفات الدوري ، cAMP ، يلعب دورا مركزيا في الاتصالات الخلوية وتنسيق العمليات الفسيولوجية المختلفة. يعمل cAMP كرسول ثان ، ينقل الإشارات الخارجية من الهرمونات أو الناقلات العصبية أو الجزيئات الأخرى خارج الخلية لبدء سلسلة من الأحداث داخل الخلايا1. علاوة على ذلك ، يشارك cAMP بشكل معقد في مسارات الإشارات المختلفة ، بما في ذلك تلك المرتبطة بمستقبلات البروتين G (GPCRs) وسيكلاز الأدينيل. يعد فهم دور cAMP في الإشارات الخلوية أمرا أساسيا لكشف الآليات المعقدة التي تكمن وراء الوظائف الخلوية الطبيعية وتطوير العلاجات المحتملة لمجموعة واسعة من الحالات الطبية2.

في الماضي ، تم استخدام طرق مختلفة لقياس cAMP بشكل مباشر أو غير مباشر. وشمل ذلك وضع العلامات الإشعاعية لتجمعات ATP الخلوية متبوعة بتنقية العمود ، HPLC ، المقايسات المناعية الإشعاعية ، والمقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم 1,2. هذه المقايسات القديمة محدودة بحقيقة أنها مقاييس نقطة النهاية ، وتتطلب عددا كبيرا من العينات لبناء استجابات تعتمد على الوقت. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مستشعرات نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) لإنشاء مقايسات في الخلايا الحية ، وإنتاج بيانات ديناميكية في الوقت الفعلي والسماح باستهداف أجهزة الاستشعار في مواقع تحت خلوية مختلفة3. تستفيد FRET من اثنين من الفلوروفورات ، ومانح فلوري واحد ، ومستقبل فلوري واحد عندما يكون على مقربة ، فإن الفلوروفور المتقبل سيكون متحمسا لناتج الفلورسنت المانح. الفلوروفوران الأكثر استخداما هما بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) نظرا لأن لهما خصائص إثارة وانبعاث متوافقة. بالإضافة إلى CFP و YFP ، يشيع استخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والبروتين الفلوري الأحمر (RFP) لأجهزة الاستشعار الحيوية FRET. تعمل المستشعرات الحيوية cAMP FRET من خلال وجود متبرع ومتقبل على طرفي نقيض من بروتين ربط Epac2 cAMP. يغير ربط cAMP تأكيد Epac ويزيد المسافة بين الفلوروفورات المانحة والمستقبلة 3,4. يتم الكشف عن هذا التغيير المطابق عن طريق فقدان FRET ، أي إثارة الفلوروفور المستقبلة بواسطة الطاقة المنقولة من قطرات الفلوروفور المانحة3. في حين أنها عملية تبدو بسيطة ، إلا أن هناك وفرة من القيود والمشكلات المتعلقة بالمستشعر الحيوي FRET لأبحاث cAMP5. أحدها هو اختيار البروتينات الفلورية ، على سبيل المثال ، GFP ، والتي يمكن أن تخفي بشكل طبيعي ، وبالتالي تقليل الحساسية6. تم استهداف أجهزة الاستشعار الحيوية cAMP القائمة على FRET إلى مجالات دقيقةمحددة 7 ، ولكن قد تكون هناك قيود بسبب الحجم الكبير للبناء مع اثنين من الفلوروفورات6. وثمة مسألة هامة أخرى تتمثل في انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإشارات FRET الناتجة عن التداخل بين إثارة وانبعاث الفلوروفور ، مما يؤدي إلى ارتفاع وتيرة أخذ العينات وتعقيد تحليل النتائج 4,5.

في الآونة الأخيرة ، قام المستشعر الحيوي الجديد (كاشف فرق cAMP في الموقع) ، cADDis بحل هذه القيود وغيرها عندما يتعلق الأمر بدراسة تنظيم إشارات cAMP8. أحد التحسينات المهمة هو الاعتماد على فلوروفور واحد. وهذا يسمح بإشارة سريعة وفعالة مع نطاق ديناميكي أوسع ونسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. نتيجة لذلك ، يمكن أن يكون هناك المزيد من الدقة نظرا لوجود نطاق أقل اتساعا من الأطوال الموجية للتمشيط منخلال 8. مثل مجسات FRET ، تم استهداف المستشعر الحيوي للمواقع تحت الخلوية ، مما يسمح بالبحث في نظرية التقسيم والاستكشاف في الطوافات الدهنية وغير الطوافات ، وغيرها من المجالات تحت الخلوية9. ولعل الأهم من ذلك هو مدى ملاءمة جهاز استشعار حيوي فلوروفور واحد للفحص عالي الإنتاجية ، مما أدى إلى تحسين الحساسية والتكاثر على أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET. يتم تعبئة المستشعر الحيوي في ناقل BacMam لسهولة نقل مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والتحكم الدقيق في تعبير البروتين.

يمكن أن يكون التحكم في التعبير عبر ناقل BacMam مفيدا بشكل خاص في المقايسات باستخدام تقويم GPCR من أنواع مختلفة لتسهيل تفسير البيانات من الدراسات على. علاوة على ذلك ، فإن التحكم في تعبير المستقبلات أمر بالغ الأهمية لقياس الدرجات المختلفة لفعالية الدواء (على سبيل المثال ، الناهضات العكسية والناهضات الجزئية) ، والمستويات المنخفضة من تعبير المستقبلات مفيدة لتقليد المستويات المنخفضة الموجودة في الأنسجة الحيوانية. BacMam هو ناقل للفيروس البقعي تم تعديله لتحويل خلايا الثدييات مثل مزارع الخلايا الأولية وخطوط HEK-29310. تسمح العلامات المهيمنة القابلة للاختيار ل BacMam بتوفير مزيد من الاستقرار مقارنة بعدوى البلازميد التقليدية11. تسمح هذه المروجين الانتقائيين بتوصيل الجينات والتعبير عنها بشكل أكثر كفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إضافة الترايكوستاتين A (مثبط هيستون ديسيتيلاز) يعزز مستويات البروتين المراسل11. يمكن التحكم في مستويات التعبير عن طريق عيار فيروس BacMam المستخدم ويجب تحسينه لكل نوع خلية. في حالة هذا المستشعر الحيوي ، يرتبط بروتين الفلورسنت الأحمر أو الأخضر ب Epac في N- و C-termini. عندما يرتبط cAMP ، يؤدي التغيير المطابق في المستشعر الحيوي إلى تحريك الأحماض الأمينية المجاورة للبروتين الفلوري. مثل هذا التحول ينقل الامتصاص من الحالة الأنيونية إلى الحالة المحايدة عند 400 نانومتر ، وبالتالي يقلل من التألق.

هناك 90-120 GPCRs يتم التعبير عنها في خلية واحدة تستجيب لمجموعة واسعة من الإشارات العصبيةالعضلية 12. لذلك ، يمكن افتراض أن ما لا يقل عن عدة عشرات من GPCRs لكل خلية يمكن أن تحفز أو تمنع cAMP من خلال اقتران Gs أو Gi ، على التوالي. بينما كان هناك تقدم في مراقبة هذا الرسول الثاني في الوقت الفعلي ، مثل FRET ، هناك حاجة إلى طرق أكثر كفاءة. يتم عرض منهجية مراقبة توليف وتدهور إشارات cAMP باستخدام cADDis في الوقت الفعلي هنا. يمكن مراقبة التغير في التألق في الوقت الفعلي باستخدام قارئ لوحة مضان للمقايسات عالية الإنتاجية أو باستخدام مجهر الفلورسنت لفحوصات الخلية الواحدة. هذه الطرق مفيدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية المتعلقة بإشارات GPCR عبر cAMP.

Protocol

يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. مقياس الطيف الضوئي لقراءة اللوحة عالي الإنتاجية

  1. بذر خلايا HEK-293 باستخدام ناقل cADDis BacMam في صفيحة 96 بئرا (اليوم 1)
    1. انقسام وإصابة الخلايا في غطاء فيروسي.
      1. وسائط HEK الدافئة (الجدول 1) و 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
      2. قم بتطهير الغطاء والمواد عن طريق مسحها بمناديل مبللة ب EtOH.
      3. قم بإزالة وسائط HEK وتجاهلها من القارورة باستخدام ماصة مصلية.
      4. أضف 5 مل من Mg2+ و Ca2+ خالية من DPBS (37 درجة مئوية) مع ماصة مصلية. قم بإمالة القارورة ذهابا وإيابا لغسل الجزء السفلي باستخدام DPBS. إزالة وتجاهل DPBS مع ماصة مصلية.
      5. التربسين الخلايا عن طريق إضافة 3 مل من التربسين-EDTA تحسنت 0.25 ٪ مع ماصة مصلية. قم بإمالة القارورة للتأكد من أن الكاشف يغطي الجزء السفلي من القارورة بالكامل. ضع الغطاء على القارورة واترك الكاشف يجلس لمدة 3-5 دقائق للسماح للخلايا بالانفصال عن القارورة.
        ملاحظة: تم تحسين هذه التجربة لقارورة 75 سم2 ؛ قد يلزم إجراء تعديلات على حجم الكواشف إذا تم استخدام جهاز استزراع مختلف الحجم.
      6. ارسم 5 مل من الوسائط الطازجة التي تحتوي على مضادات حيوية. طرد ورسم حجم القارورة لغسل جدران القارورة وفصل الخلايا فعليا.
      7. اجمع الحجم الكلي للقارورة (8 مل) وأجهزة الطرد المركزي (25 درجة مئوية) في أنبوب سعة 15 مل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
      8. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية ، واحرص على عدم إزعاج الحبيبات.
      9. لغسل الخلايا دون إزعاج الحبيبات ، أضف 500 ميكرولتر من DPBS بدون Mg2+ و Ca2+ DPBS إلى جانب أنبوب 15 مل. بعد إضافة DPBS برفق ، قم بإزالة وتجاهل أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت دون إزعاج الحبيبات. كرر مرة أخرى.
      10. عد الخلايا واضبطها على كثافة خلية تبلغ 250000 خلية / خلية مل.
      11. اصنع مزيجا رئيسيا بناء على أحجام الكاشف المطلوبة لكل بئر من صفيحة 96 بئرا سوداء شفافة القاع. يشار إلى هذا باسم "صفيحة الأنسجة". انظر المجلدات أدناه:
        ملاحظة: مثال على بئر واحد (الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر): 40 ميكرولتر من ناقل BacMam للمستشعر الحيوي (مخزون 2 × 1010 جينات فيروسية / مل) ، 2 ميكرولتر تريكوستاتين A (مخزون 100 ميكرومتر ؛ التركيز النهائي 1 ميكرومتر) ، 158 ميكرولتر من 250000 خلية / مل كثافة الخلايا. مثال على 10 آبار (الحجم الإجمالي 2 مل): 400 ميكرولتر من ناقل BacMam الحيوي (مخزون 2 × 1010 جينات فيروسية / مل) ، 20 ميكرولتر من الترايكوستاتين A (مخزون 100 ميكرومتر) ، وسائط 1,580 ميكرولتر مع كثافة خلية 250,000 خلية / مل.
      12. أضف 200 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة لمدة 24 ساعة قبل تشغيلها على مقياس الطيف الضوئي لقراءة اللوحة.
  2. يعمل على قارئ لوحة
    1. على سطح الطاولة ، قم بإزالة جميع الوسائط بعناية في كل بئر واستبدلها ب 180 ميكرولتر من DPBS مع Mg2+ و Ca2+ عند 37 درجة مئوية.
    2. افحص الخلايا على المجهر للتأكد من صحة الخلية.
    3. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة -1 ساعة.
    4. أثناء الحضانة ، قم بإعداد الأدوية للقراءة عند تخفيف 1:10 (وتسمى أيضا 10 أضعاف) للجرعة النهائية المطلوبة. وبالتالي ، إعداد 100 ميكرومتر فورسكولين و 100 نانومتر الأيزوبروتيرينول.
    5. أضف 60 ميكرولتر من كل دواء بطريقة عمودية إلى صفيحة شفافة من 96 بئرا (يشار إليها باسم "لوحة الدواء").
      ملاحظة: مع التخفيف المناسب للدواء ولتحسين القراءة ، تتم إضافة الأدوية إلى لوحة 96 بئرا واضحة ، يشار إليها باسم "لوحة الدواء" ، ليتم نقلها في وقت القراءة إلى "لوحة الأنسجة" باستخدام 96-multi pipettor ، مما يسمح بإضافة الدواء إلى جميع الآبار في وقت واحد وقراءته بسرعة بواسطة مقياس الطيف الضوئي الفلوري.
  3. إعداد قارئ لوحة مضان
    1. اضبط إعدادات قارئ اللوحة الفلورية.
      1. وضع القراءة: مضان. نوع القراءة: حركي. قراءة الأطوال الموجية: 494 نانومتر و 522 نانومتر.
      2. وقت القراءة: أدخل 3 دقائق لقراءة الفلورسنت الأساسية و 7 دقائق لإضافة ما بعد الدواء ". الفاصل الزمني" ك 00:00:30 لمدة 30 ثانية بين كل قراءة.
        ملاحظة: يمكن تحسين وقت القراءة وزيادته بناء على الوقت المطلوب.
  4. الحصول على البيانات
    1. قم بإزالة لوحة الأنسجة من الحاضنة ، وقم بإزالة رقائق الألومنيوم وغطاء اللوحة ، وضع لوحة الأنسجة في قارئ اللوحة. أغلق درج القارئ للسماح للوحة المناديل بالراحة والتوازن مع درجة حرارة القارئ (37 درجة مئوية).
    2. ضع الصفيحة الشفافة المكونة من 96 بئرا (لوحة الدواء) مع تخفيفات الدواء تحت ماصة 96 متعددة وتدرب على سحب 20 ميكرولتر من الآبار. تأكد من وجود كمية متساوية من الدواء المسحوب في أطراف الماصة.
    3. بدء تشغيل قياس "خط الأساس".
      ملاحظة: 40 RFU أو أعلى تعتبر بيانات قابلة للتطبيق. إذا كانت البيانات أقل من هذه القيمة ، فيجب إيقاف التجربة وتجاهلها.
    4. ستخرج لوحة الأنسجة من القارئ في نهاية تشغيل خط الأساس. أضف بسرعة وبعناية 20 ميكرولتر من لوحة الدواء الشفافة إلى لوحة الأنسجة السوداء. ثم ، ابدأ بسرعة تشغيل "العلاج". يجب ألا تكون لوحة الأنسجة خارج القارئ لأكثر من 30 ثانية بعد إضافة الأدوية.
      ملاحظة: إذا تمت إضافة الدواء بسرعة كبيرة ، تنفصل الخلايا عن لوحة الأنسجة ، مما يخلق تجربة غير صالحة للاستعمال. بالإضافة إلى ذلك ، تصاب الخلايا ببروتين فلوري أخضر حساس للضوء. وبالتالي ، فإن إضافة الأدوية بسرعة وسرعة وبدء القراءة الثانية أمر حتمي لتجنب تفويت الجزء المبكر من الاستجابة.
    5. بمجرد اكتمال القراءة الثانية ، تأكد من إخراج لوحة الأنسجة من القارئ والانتهاء من جمع البيانات.
      ملاحظة: قبل التخلص من صفيحة الأنسجة ، من أفضل الممارسات التحقق من أن الخلايا لا تزال متصلة باللوحة. مراقبة الخلايا تحت المجهر. إذا انفصلت الخلايا ، تكون النتائج غير صالحة ويجب التخلص منها. سوف تحتاج إلى تكرار التجربة.
    6. تصدير البيانات الناتجة كملف Excel.
    7. افتح بيانات Excel القابلة للقراءة التي تم تصديرها من قارئ اللوحة وانسخ المعلومات ذات الصلة والصقها في قالب تحويل Excel. ستتحول البيانات من قارئ اللوحة الذي تم إعداده إلى بئر واحد ، وقراءات الأعمدة على يمين البيانات المنسوخة.
      ملاحظة: يتم سرد أعمدة التألق لبئر بمرور الوقت في RFUs (بعنوان تحويل العمود) وكتغيير عشري بالنسبة لقراءة RFU في القراءة الأولية (t0 بعنوان Delta F). في قالب Excel، يتم تعيين جدول Delta F إلى آخر قراءة أساسية قبل إضافة الدواء. هذه هي نقطةجمع البيانات 6 .
    8. بعد تحويل البيانات ، انسخ البيانات من Delta F والصقها في برنامج تحليل البيانات على شكل اضمحلال أو اضمحلال نسبي في التألق بمرور الوقت.
    9. قم بتغيير عنوان X إلى "الوقت (الأوقات)" والعنوان Y إلى "ΔF / F0" للقيم العشرية النسبية.

2. مقايسة أحادية الخلية باستخدام مجهر فلوري مقلوب

  1. خلايا البذر (HASM) باستخدام ناقل cADDis BacMam في طبق 35 مم (اليوم 1)
    1. انقسام وإصابة الخلايا في غطاء فيروسي.
      1. وسائط HASM الدافئة (الجدول 1) ، 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      2. قم بتطهير الغطاء والمواد وامسح الغطاء بمناديل مبللة ب EtOH.
      3. قم بإزالة وسائط HASM والتخلص منها من القارورة باستخدام ماصة مصلية.
      4. أضف 5 مل من Mg2+ و Ca2+ DPBS مجانا (37 درجة مئوية) مع ماصة مصلية جديدة وقم بإمالة القارورة لغسل القاع باستخدام DPBS.
      5. التربسين الخلايا عن طريق إضافة 3 مل من التربسين-EDTA تحسنت 0.25 ٪ مع ماصة مصلية. قم بإمالة القارورة للتأكد من أن الكاشف يغطي الجزء السفلي من القارورة بالكامل. دع الكاشف يجلس لمدة 3-5 دقائق للسماح للخلايا بالانفصال عن القارورة.
      6. ارسم 5 مل من الوسائط الطازجة التي تحتوي على مضادات حيوية واطرد الماصة لإزالة الخلايا من قاع القارورة.
      7. اجمع الحجم الكلي لجهاز الطرد المركزي القارورة (8 مل) في أنبوب طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
      8. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية ، واحرص على عدم إزعاج الحبيبات.
      9. دون إزعاج الحبيبات ، أضف 500 ميكرولتر من DPBS بدون Mg2+ و Ca2+ DPBS إلى جانب أنبوب الطرد المركزي. قم بإزالة وتجاهل أكبر قدر ممكن من السوائل وكرر مرة أخرى.
        ملاحظة: تم تحسين هذه التجربة لقارورة 75 سم2 ؛ قد يلزم إجراء تعديلات على حجم الكواشف إذا تم استخدام جهاز استزراع مختلف الحجم.
      10. عد الخلايا واضبطها على 40000 خلية / مل كثافة الخلايا.
      11. اصنع مزيجا رئيسيا بناء على حجم الكاشف المطلوب لكل بئر في طبق 35 مم. انظر المجلدات أدناه:
        ملاحظة: مثال على بئر واحد (الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر): 20 ميكرولتر من ناقل BacMam للمستشعر الحيوي (مخزون 2 × 1010 جينات فيروسية / مل) ، 5 ميكرولتر تريكوستاتين A (مخزون 100 ميكرومتر ، التركيز النهائي 1 ميكرومتر) ، 500 ميكرولتر من 40000 خلية / مل كثافة الخلية. مثال ل 4 آبار (الحجم الكلي 2 مل): 80 ميكرولتر من ناقل BacMam الحيوي (مخزون الجينات الفيروسية / مل) ، 20 ميكرولتر من الترايكوستاتين A (مخزون 100 ميكرومتر ، التركيز النهائي 1 ميكرومتر) ، 2000 ميكرولتر وسائط 40000 خلية / مل كثافة الخلية.
      12. أضف 500 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة قبل متابعة التجربة.
        ملاحظة: قد يختلف رقم الخلية وفقا لخط الخلية. لتجنب تداخل الخلايا للتحليل، استخدم أرقام خلايا منخفضة.
  2. تحضير العوامل الدوائية (اليوم 2)
    1. قم بإزالة الوسائط بعناية في كل بئر واستبدلها ب 450 ميكرولتر من DPBS مع Mg2+ و Ca2+ عند 37 درجة مئوية.
    2. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتضن القرص مقاس 35 مم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة -1 ساعة.
    3. افحص الخلايا على المجهر للتأكد من صحة الخلية.
    4. في غضون ذلك ، قم بإعداد الأدوية لقراءة وحدة سجل 1 فوق التركيز النهائي المطلوب (أكبر 10 أضعاف). وبالتالي ، إعداد 100 ميكرومتر فورسكولين و 100 نانومتر الأيزوبروتيرينول.
    5. بالنسبة لعيار جرعة السجل ، قم بإعداد الدواء عند 10 mM واستخدم التخفيفات التسلسلية لتحقيق 100 ميكرومتر من فورسكولين و 100 نانومتر من الأيزوبروتيرينول.
  3. الحصول على البيانات
    ملاحظة: الإعدادات التالية خاصة بالمجهر المقلوب الفلوري. يمكن أن يختلف البرنامج المصاحب لكل مجهر. يتم وصف الإعدادات العامة المستخدمة في البروتوكول الحالي هنا.
    1. قم بتشغيل المحور المركزي ، ثم مجهر الفلورسنت المقلوب.
    2. افتح البرنامج الذي سيتم استخدامه للالتقاط واختر خيار التقاط الفاصل الزمني .
    3. ضع حامل عينة طبق 35 مم في مرحلة المجهر.
    4. اضبط العدسة الموضوعية على x20.
    5. استخدم التركيز البؤري التلقائي واحصل على صورة واضحة قدر الإمكان. إذا كان من الصعب العثور على خلايا فردية ، فابدأ بهدف 4x ، ثم انتقل إلى 20x. ركز العينة يدويا إذا كان المجهر يفتقر إلى ميزة التركيز البؤري التلقائي.
      ملاحظة: يمكن استخدام تكبير 40x إذا كانت هناك حاجة إلى تفاصيل مورفولوجية أكثر أهمية للخلية.
    6. اضبط الإعدادات التالية للحصول على الحصول على البيانات الأمثل: السطوع التلقائي (التعرض) ، الطول الموجي للإثارة ، توازن اللون الأسود (لتقليل ضوضاء الخلفية) ، التركيز التلقائي.
    7. بعد العثور على منطقة رؤية بها العديد من خلايا الفلورة السيتوبلازمية ، احصل على البيانات باستخدام التقاط الفاصل الزمني لمدة 20 دقيقة كل 30 ثانية.
    8. انقر فوق Go لبدء القراءة.
    9. اركض لمدة 3 دقائق لجمع خط الأساس. بمجرد أخذ التقاط 3 دقائق ، أضف بلطف 50 ميكرولتر من الدواء إلى البئر المناسب. عند إضافة الأدوية ، سيكون التركيز النهائي على الطبق 10 ميكرومتر فورسكولين و 10 نانومتر من الأيزوبروتيرينول.
      ملاحظة: يجب إضافة الدواء بعناية. لا تلمس اللوحة بطرف الماصة ، لأن هذا قد يحرك مجال الرؤية الذي تم إنشاؤه ويجعل العينة غير قابلة للتحليل.
    10. اترك التجربة ليتم تشغيلها لمدة 17 دقيقة أخرى مع التقاط البيانات كل 30 ثانية.
    11. بمجرد اكتمال الاختبار ، تأكد من أن البيانات جاهزة للتحليل.
      ملاحظة: على الرغم من أن البروتوكول الحالي لا يتضمن عنصر تحكم للانحراف البؤري ، فقد يكون من المفيد تضمين واحد في التجربة. على سبيل المثال ، يمكن أن يساعد استخدام الأصباغ النووية في إدارة الانجراف البؤري أثناء تحليل المجهر ، خاصة عند التقاط صور للخلايا الحية على مدى فترات طويلة. عادة ما يتم توزيع المستشعرات الحيوية cADDis على نطاق واسع داخل الخلية ، مما يجعل المستوى البؤري الواسع هو الالتقاط الأكثر فعالية ويقلل من الحاجة إلى التحكم في الانجراف البؤري9.
  4. تحليل البيانات
    ملاحظة: يمكن أن يختلف البرنامج المصاحب لكل مجهر ، لذلك يتم وصف الإعدادات العامة التي يجب استخدامها لتحليل الصور الملتقطة هنا.
    1. افتح ملفات الصور التي تم التقاطها أثناء التجربة.
    2. استخدم أداة المضلع أو الدائرة لتحديد منطقة اهتمام كل خلية لإجراء التحليل. يجب أن يعطي التحليل سطوع كل خلية في كل نقطة زمنية.
      ملاحظة: أفضل ممارسة هي تحديد خلايا فردية وليس الخلايا التي تلامس جدار الطبق أو الخلايا الأخرى. هذا يضمن أفضل جمع ممكن للبيانات. حدد ما لا يقل عن 5 خلايا للتحليل داخل كل شرط ، وقم بتكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.
    3. بعد تحليل البيانات ، افتح البيانات في ورقة Excel واحسب متوسط السطوع لكل حالة في كل صورة ، بدءا من الصورة قبل إضافة العوامل الدوائية أو السيارة. في هذا المثال ، عند علامة 3 دقائقأو الصورة السادسة التي تم التقاطها على المجهر ، حيث يتم التقاط كل صورة كل 30 ثانية.
    4. احسب ΔF / F0 لكل متوسط قيمة في كل حالة.
    5. قم بالتحميل في برنامج التحليل الإحصائي وارسم ΔF / F0 مقابل الوقت في s.
      ملاحظة: يقدم الشكل 1 لمحة عامة تخطيطية عن الخطوات الرئيسية للبروتوكولات.

النتائج

أثبتت الدراسة الحالية صحة المستشعر الحيوي الخلوي في كل من قارئ الألواح ومقايسات المجهر. بمجرد أن تعبر الخلايا عن المستشعر الحيوي ، يتم تحفيزها إما باستخدام 10 ميكرومتر فورسكولين (منشط مباشر لأدينيل سيكلاز) ، أو 10 نانومتر إيزوبروتيرينول (ناهض عند ß1AR و ß2AR) ، أو مركبة (?...

Discussion

يعد القياس الدقيق والحساس ل cAMP أمرا بالغ الأهمية لفهم دوره في العمليات الخلوية المختلفة ولدراسة نشاط مسارات الإشارات المعتمدة على cAMP. هناك العديد من الطرق المستخدمة بشكل شائع لقياس مستويات cAMP ، بما في ذلك ELISA ، والمقايسة المناعية الإشعاعية ، وأجهزة الاستشعار الحيوية FRET ، ومقايسة GloSensor cAMP

Disclosures

وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI) (HL169522).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate (clear)Fisherbrand21-377-203
35 mm dishGreiner Bio-One627870Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate Corning3904Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscopeKeyence
Calcium chloride (IM)Quality Biological IncE506For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM (1x)Gibco11965092HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+ Gibco14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+Corning14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D systemsS11195For HEK and HASM media
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham's F-12K Gibco21127022For HASM media
HEPES (1M)Gibco15630080For HASM media
IsoproterenolSigmaI6504Drug
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotic for HASM media
RNAse awayThermo Scientific700511Reagent
Sodium hydroxide solutionSigmaS2770For HASM media
Spectrmax M5 plate readerMolecular Devices
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagent
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagent

References

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  4. Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
  5. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  6. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  7. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
  8. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
  9. Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
  10. Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
  11. Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
  12. Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
  13. Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
  14. Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
  15. Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
  16. Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
  17. Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
  18. Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
  19. Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
  20. Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
  21. Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
  22. De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
  23. Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
  24. Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
  25. Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
  26. Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
  27. Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CAMP Biosensor CADDis Epac2 CAMP HEK 293 HASM 96 CAMP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved