إعادة تكوين قناة مستقبلات الغلوتامات البكتيرية عن طريق تغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة المستحلب المقلوب المستخدمة لتغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا (CFE) داخل حويصلة عملاقة أحادية الصفيحة (GUV) للتحقيق في تخليق ودمج بروتين غشاء نموذجي في طبقة الدهون المزدوجة.

Abstract

تعد أنظمة التعبير الخالي من الخلايا (CFE) أدوات قوية في البيولوجيا التركيبية تسمح بالتقليد الحيوي للوظائف الخلوية مثل الاستشعار الحيوي وتجديد الطاقة في الخلايا الاصطناعية. ومع ذلك ، تتطلب إعادة بناء مجموعة واسعة من العمليات الخلوية إعادة تكوين ناجحة للبروتينات الغشائية في غشاء الخلايا الاصطناعية. في حين أن التعبير عن البروتينات القابلة للذوبان عادة ما يكون ناجحا في أنظمة CFE الشائعة ، فقد ثبت أن إعادة تكوين البروتينات الغشائية في الطبقات الثنائية الدهنية للخلايا الاصطناعية يمثل تحديا. هنا ، يتم عرض طريقة لإعادة تكوين بروتين غشاء نموذجي ، مستقبلات الغلوتامات البكتيرية (GluR0) ، في حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كخلايا اصطناعية نموذجية تعتمد على تغليف وحضانة تفاعل CFE داخل الخلايا الاصطناعية. باستخدام هذه المنصة ، تم إثبات تأثير استبدال ببتيد الإشارة N-terminal ل GluR0 بببتيد إشارة proteorhodopsin على النقل المشترك الناجح ل GluR0 إلى أغشية GUVs الهجينة. توفر هذه الطريقة إجراء قويا يسمح بإعادة تكوين البروتينات الغشائية المختلفة في الخلايا الاصطناعية الخالية من الخلايا.

Introduction

اكتسبت البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى اهتماما متزايدا على مدى العقد الماضي كمجال ناشئ مع العديد من التطبيقات المحتملة في الهندسة الحيوية ، وتوصيل الأدوية ، والطب التجديدي^1،2. اجتذب تطوير الخلايا الاصطناعية كحجر زاوية في البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى ، على وجه الخصوص ، مجموعة واسعة من المجتمعات العلمية بسبب التطبيقات الواعدة للخلايا الاصطناعية بالإضافة إلى خصائصها الفيزيائية والكيميائية الحيوية الشبيهة بالخلايا التي تسهل الدراسات الفيزيائية الحيوية في المختبر ^{3،4،5،6....}

Protocol

وترد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تفاعلات CFE السائبة في وجود حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة (SUVs)

1. إعداد سيارات الدفع الرباعي
   ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان باتباع تعليمات السلامة للعمل مع الكلوروفورم.
   1. تحضير 5 مللي متر 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين (POPC) سيارات الدفع الرباعي في قنينة زجاجية عن طريق نقل 76 ميكرولتر من محلول مخزون الملوثات العضوية الثابتة 25 ملغم / مل المذاب في الكلوروفورم.
   2. أثناء تدوير القارورة الزجاجية برفق ، قم بنفخ تيار لطيف من الأرجون في القارورة لتشكيل طبقة من الدهون المجففة في الأسفل. بعد ذلك ، قم بنق....

النتائج

قبل تغليف تفاعلات CFE ، تم التعبير عن نوعين مختلفين من GluR0-sfGFP يؤويان ببتيدات إشارة أصلية وبروتيورهودوبسين (يتم عرض تسلسل ببتيد الإشارة في الجدول التكميلي 1) ، وتم التعبير عن sfGFP القابل للذوبان بشكل فردي في تفاعلات مجمعة ، وتم رصد تعبيرهما عن طريق اكتشاف إشارة sfGFP باستخدام ق?.......

Discussion

تقريبا أي عملية خلوية تعتمد على نقل الجزيئات أو المعلومات عبر غشاء الخلية ، مثل إشارات الخلية أو إثارة الخلية ، تتطلب بروتينات غشائية. وهكذا ، أصبحت إعادة تكوين البروتينات الغشائية عنق الزجاجة الرئيسي في تحقيق تصميمات الخلايا الاصطناعية المختلفة لتطبيقات مختلفة. تتطلب إعادة تكوين البرو?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600