A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم طريقة لتكرار البيئة المكروية للورم الدبقي في الجبهة الغازية التي تتضمن تدفق السائل الخلالي. هذا النموذج عبارة عن هيدروجيل هيالورونان كولاجين I في إدراج ثقافة الأنسجة حيث يمكن تطبيق رأس ضغط السوائل. يمكن تحديد الغزو كميا ، ويمكن عزل الخلايا أو تحللها.

Abstract

يعد تكرار الورم الأرومي الدبقي عائقا رئيسيا أمام نجاح العلاج وهو مدفوع بغزو الخلايا الجذعية للورم الدبقي (GSCs) إلى الأنسجة السليمة التي يتعذر الوصول إليها للاستئصال الجراحي ومقاومة للعلاجات الكيميائية الحالية. تنظم حركة السوائل على مستوى الأنسجة ، أو تدفق السائل الخلالي (IFF) ، غزو GSC بطريقة تعتمد على البيئة المكروية للورم (TME) ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى أنظمة نموذجية تتضمن كلا من IFF و TME. نقدم طريقة يمكن الوصول إليها لتكرار TME الغازي في الورم الأرومي الدبقي: هيدروجيل هيالورونان كولاجين I يتكون من GSCs البشرية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة المزروعة في إدراج زراعة الأنسجة. يمكن تمثيل IFF المرتفع عن طريق تطبيق رأس ضغط السوائل على الهيدروجيل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ضبط هذا النموذج لتكرار الاختلافات بين المرضى أو داخلهم في النسب الخلوية أو معدلات التدفق أو صلابة المصفوفة. يمكن تحديد الغزو كميا ، بينما يمكن حصاد المواد الهلامية لمجموعة متنوعة من النتائج ، بما في ذلك غزو GSC ، أو قياس التدفق الخلوي ، أو استخراج البروتين أو الحمض النووي الريبي ، أو التصوير.

Introduction

الورم الأرومي الدبقي هو مرض مدمر ، يتميز بالبقاء على قيد الحياة1 الذي يمتد بشكل معتدل فقط من خلال العلاجات المتاحةسريريا 2،3. هذا العائق أمام العلاج الفعال مدفوع إلى حد كبير بالطبيعة شديدة الارتشاح للخلايا الجذعية للورم الدبقي المقاوم للعلاج الكيميائي (GSCs) التي يتعذر الوصول إليها لاستئصال الأورام المتكررةوالبذور 4. في الوقت نفسه ، تعتبر GSCs شديدة البلاستيك ، وتستجيب للمنبهات المتنوعة في البيئة المكروية للورم (TME) من أجل البقاء على قيد الحياة وغزو5،6. على وجه التحديد ،....

Protocol

تم تطوير هذا البروتوكول وفقا للإرشادات التي وضعتها لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية في Virginia Tech.

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات في خزانة زراعة الخلايا BSL-2 ما لم ينص على خلاف ذلك. يرجى استشارة لجنة السلامة البيولوجية التابعة للمؤسسة للحصول على إرشادات حول استخدام الخلايا البشرية.

1. حسابات تحضير الجل

  1. احسب عدد الشروط اللازمة للتجربة.
    ملاحظة: يتم تحديد "الحالة" من خلال محتويات المحلول (على سبيل المثال ، تركيزات الخلايا ، وتركيزات الكولاجين ، وما إلى ذلك) ، وليس المتغيرات المطبقة خارجيا ، مثل رأس ضغط السائل المستخدم في هذا المثال.
  2. احسب....

النتائج

يتم توفير بيانات تمثيلية للغزو (الشكل 3) ، والجدوى ، والتعبير عن Ki67 و CD71 عبر قياس التدفق الخلوي (الشكل 4) لخطوط GSC كما تم نشرها سابقا لهيدروجيل الهيالورونان والكولاجينالمعدل 12. إن وجود الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة د.......

Discussion

يتضمن تجميع نموذج TME ست خطوات أساسية: 1) تمرير الخلايا وفصل الخلايا بين ظروف متشابهة ، 2) تجميع محلول كولاجين مركز لجميع الظروف ، 3) الجمع بين مكونات الجل (الخلايا ، والكولاجين ، وحمض الهيالورونيك الميثاكريلاتي ، والبادئ الضوئي) لكل حالة 4) طلاء المواد الهلامية ، 5) التشابك عن.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر مصادر التمويل لهذا العمل: المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة (R37 CA222563 إلى JM) ، ومؤسسة كولتر (JM) ، وVirginia Tech ICTAS-CEH (J.M. & J.H.). تم اشتقاق GSCs المستخدمة في هذا الاختبار بواسطة Jakub Godlewski ، دكتوراه (كلية الطب بجامعة هارفارد).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Tissue Culture Plate, SterileCelltreat Scientific Products 229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, SterileDOT Scientific667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA Thorlabs M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, SterileCelltreat Scientific Products229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm DiameterMillicellPI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology GradeThermo Fisher ScientificT038181000CSEthanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull)ScienCell Research Laboratories1801Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin. 
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco)Thermo Fisher Scientific12587010
BSA (MACS)Miltenyi Biotec 130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen)Fisher Scientific 25-0719-41
Cell Counting Chambered SlidesNexcelom BioscienceCHT4-PD100-002
Cell ScrapersBiologix USA 70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience)VWR NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge - Low-SpeedEppendorf 5702 RCentrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, CorningFisher Scientific07-200-108V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific50116047
Collagen I, High Concentration, Rat TailCorning354249
Collagen I, Rat TailCorning354236"Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1)United States BiologicalC7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nmThorlabsCOP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips AmazonB01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7) United States BiologicalD3760
DMEM, high glucose (Gibco)Thermo Fisher Scientific11330032
EVOS FLInvitrogenAMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco)Thermo Fisher Scientific26140079For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaHT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen)Thermo Fisher Scientific00-5523-00
Glioma stem cellsn/an/aCan be patient derived or commercial glioma stem cell lines. 
Guava easyCyte HT SystemMillipore Sigma0500-4008Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaH6648
HEPES (1 M) (Gibco)Thermo Fisher Scientific15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max ThorlabsDC2200Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific62249
Human AstrocytesScienCell Research Laboratories1800Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0021
Immortalized Human Microglia - hTERTApplied Biological Materials T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 positionBenchmark Scientific H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibodyMiltenyi Biotec130-120-420
LED UV Curing MeterGigahertz-OptikX1-RCH-116Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Advanced Biomatrix5269-100MG Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificL24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA)Advanced Biomatrix5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)Fisher Scientific75-997-203Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco)Thermo Fisher Scientific17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco)Thermo Fisher Scientific10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & MgQuality Biological119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)VWR 97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma)Fisher Scientific SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco)Thermo Fisher Scientific25200056
ViaStain AOPI Staining SolutionNexcelom BioscienceCS2-0106

References

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020. Neuro Oncol. 25, 1-99 (2023).
  2. Stupp, R., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved