JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم طريقة للتعليق التوضيحي القائم على قياس الطيف الكتلي السريع (MS) / قياس الطيف الكتلي (MS) وتصنيف قلويدات التروبان ، وهي مفيدة لكل من التكرار الأولي للعينات المحتوية على التروبان واكتشاف قلويدات جديدة للعزل.

Abstract

على الرغم من أن العديد من الأدوية المستخدمة اليوم اصطناعية في الأصل ، إلا أن المنتجات الطبيعية لا تزال توفر مصدرا غنيا للتنوع الكيميائي الجديد والنشاط البيولوجي ، ويمكن أن تسفر عن خيوط واعدة للأمراض المقاومة أو الناشئة. ومع ذلك، فإن التحدي ذو شقين: لا يجب على الباحثين العثور على المنتجات الطبيعية وتوضيح هياكلها فحسب، بل يجب عليهم أيضا تحديد ما يستحق العزل والفحص (وما هو معروف بالفعل - وهي عملية تعرف باسم إزالة التكرار). مع ظهور الأجهزة التحليلية الحديثة ، تسارعت وتيرة اكتشاف المنتجات الطبيعية وإلغاء تكرارها. أصبح قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) تقنية ذات قيمة خاصة لتحديد وتصنيف الهياكل الكيميائية. قلويدات التروبان (TAs) هي مركبات مشتقة من النباتات ذات أهمية طبية وسمية كبيرة. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير سير عمل فحص قائم على LC-MS / MS باستخدام تكوينات MS / MS المتعددة المتاحة على مطياف الكتلة الثلاثي الرباعي (QQQ) للتعليق على هياكل TA وتصنيفها بناء على أنماط التجزئة المميزة الخاصة بها. باستخدام مجموعة من عمليات المسح الأيوني للمنتج المعتمدة على البيانات (DD) ، ومسح أيون السلائف (PrIS) ، ومسح الخسارة المحايدة (NLS) ، قمنا بتطبيق هذه الطريقة على مقتطفات غنية ب TA من الباذنجان Datura stramonium و Datura metel. هذه الطريقة سريعة وحساسة ، وقد تم استخدامها بنجاح لكل من التكرار الأولي للعينات المعقدة المحتوية على TA ولاكتشاف مرشح جديد للعزل والتنقية (والمقايسة الحيوية في نهاية المطاف).

Introduction

على الرغم من أن الجزيئات الاصطناعية بالكامل أصبحت أكثر بروزا في اكتشاف الأدوية في العقود الأخيرة، إلا أن ما يقرب من ثلثي جميع الأدوية المعتمدة من السنوات ال 39 الماضية هي منتجات طبيعية أو مستوحاة من المنتجات الطبيعية،1،2 مما يؤكد الأهمية المستمرة لأبحاث المنتجات الطبيعية. قلويدات ، بعض المنتجات الطبيعية المحتوية على النيتروجين ، تحظى بتقدير خاص لخصائصها الطبية. قلويدات التروبان (TAs) التي تحتوي على [3.2.1.]- نظام يحتوي على النيتروجين ثنائي الحلقات ، يتم إنتاجه في الغالب بواسطة النباتات في عائلات الباذنجانيات (الباذنجان) ، و Erythroxylaceae ، و Convolvulaceae. ومن الأمثلة على ذلك الأتروبين والسكوبولامين والكوكايين. كما تستخدم العديد من التروبان شبه الاصطناعية أو الاصطناعية سريريا3. تستخدم TAs ومشتقاتها لعلاج العديد من الحالات 3,4 ويظهر العديد من هذه الأدوية في قائمة منظمة الصحة العالمية لعام 2023 للأدوية الأساسية5. بسبب أنشطتها القوية ، تستخدم TAs أيضا بشكل ترفيهي (كمنشطات أو هذيان) ويمكن أن تسبب التسمم عند تناول النباتات (أو المستحضرات) التي تحتوي عليها 6,7. TAs غير مرغوب فيها في الأغذية البشرية والحيوانية8 ويمكن أن تلوث الشاي والتوابل والحبوب والعسل والمكملات العشبية 9,10. نظرا لوعدها الطبي وقدرتها على السم ، فإن الطرق التحليلية التي يمكن أن تساعد في اكتشاف TAs جديدة (وتحديد TAs المعروفة) مفيدة.

في قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS / MS) ، يتم إقران "مرشحات الكتلة" (على سبيل المثال ، رباعيات الأقطاب ، وأنابيب وقت الطيران) معا فيزيائيا ("في الفضاء") ، أو يستخدم الجهاز خطوات تفاعل / فصل إضافية "في الوقت المناسب". يستخدم MS / MS في الفضاء طرقا مختلفة لتحديد وتجزئة أيونات مختلفة عند مرشحات الكتلة المختلفة (على سبيل المثال ، رباعيات الأقطاب لجهاز ثلاثي الأقطاب أو QQQ). يمكن استخدام هذه الأنماط المختلفة لتحديد الأجزاء المحددة التي يتم تصنيعها بواسطة أيون معين (مسح أيون المنتج) ، أو الأيونات الموجودة في العينة التي تنتج شظايا معينة (مسح أيون السلائف أو PrIS) أو تتعرض لخسائر كتلة مميزة (مسح الخسارة المحايدة أو NLS) ، أو المركبات المحددة التي تمتلك شظايا محددة (مراقبة التفاعل المتعدد). لذلك ، يوفر MS / MS شظايا مفيدة لاقتراح هياكل لمركبات جديدة أو تأكيد وجود مركب موجود. يستخدم MS / MS بشكل متزايد في اكتشاف الأدوية ، وكيمياء المنتجات الطبيعية ، ومجالات الأيض11،12 ، وقد تم استخدامه لتحديد الأنواع المحتوية على قلويدات (للتوصيف الكيميائي النباتي أو التحليل الكيميائي التصنيفي) وللكشف عن قلويدات معينة وتحديدها في الأغذية أو النباتات الطبية10،13،14،15،16.

على الرغم من العديد من تقنيات قياس الطيف الكتلي المتاحة ، هناك تحديات في العثور على قلويدات جديدة. بالإضافة إلى العثور على كائن حي مرشح لفحصه ، فإن التأكيد الهيكلي الكامل للقلويد هو عملية شاقة قد تتضمن العديد من التقنيات التحليلية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين عزل مركب معروف بالفعل ، مما يهدر العمل والوقت والموارد. هذا صعب بشكل خاص على TAs ، حيث يتم الإبلاغ عن المئات ، إن لم يكن الآلاف من TAs ، وكثير منها متساوي مع بعضها البعض. تعرف عملية "تحديد المعروفين وتمييزهم عن المجهولين" باسم dereplication. يتم نشر قواعد بيانات أوقات الاحتفاظ (r.t.s) وشظايا الكتلة من TAs المختلفة والمركبات الأخرى للمساعدة في هذه العملية17,18. ومع ذلك ، فإن إلغاء النسخ أمر شاق. مجرد التعليق التوضيحي (أي تعيين الهياكل المفترضة) على القلويدات في مخطط كروماتوجرام LC-MS / MS بالكامل للعينة يستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام كل من الشبكات الجزيئية19،20 و dereplicationاليدوي 18،21،22 لبنزيل إيزوكينولين ، إندول مونوتربين ، وقلويدات التروبان ، وتم استخدام PrISs "للترشيح الهيكلي" للأطياف لتحديد قلويدات بيروليزيدين والسولانين23,24. لا توجد طرق أو مهام سير عمل محددة متاحة للتكرار السريع القائم على LC-MS / MS للعينات المحتوية على TA ، على الرغم من أن TAs تمتلك شظايا شائعة يسهل التعرف عليها (الشكل 1). تستخدم الطريقة الموصوفة هنا مجموعة من عمليات المسح الأيوني للمنتجات المعتمدة على البيانات (DD) ، و PrISs ، و NLSs لشرح وتصنيف هياكل TA في النباتات بناء على كل من أنماط التجزئة المميزة للتروبان أحادي وثنائي وثلاثي الاستبدال (الشكل 1 أ) وفقدان مجموعات الإستر الشائعة الموجودة في هذه القلويدات (الشكل 1 ب). الكائنات الحية للدراسة هي عدة أنواع في جنس الباذنجان الداتورة. مصدر غني للتنوع TAs ، تم استخدام الداتورة عبر تاريخ العالم للأغراض الطبية والثقافية17- وهي مصفوفة صعبة لإلغاء تكرارها بسبب العديد من TAs المتشابهة هيكليا ، مما يوفر لنا عينات جذابة لاختبار طريقتنا.

Protocol

تنبيه: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل استخدام المواد الكيميائية المدرجة.

1. إعداد العينة

تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل حروقا بالتبريد . استخدم قفازات التبريد وحماية العين في منطقة جيدة التهوية. يمكن أن تكون عينات النباتات المحتوية على قلويد مزعجة للجلد. تعامل معهم دائما بالقفازات. الميثانول سام وقابل للاشتعال ويجب التعامل معه في غطاء دخان بعيدا عن مصادر الاشتعال المحتملة.

ملاحظة: من الناحية النظرية ، يمكن استخدام الأنسجة النباتية المزروعة أو البرية (المجففة أو المطحونة طازجة) ؛ الإجراء أدناه هو فقط الإجراء المستخدم أثناء تطوير الطريقة.

  1. إذا كانت الأنسجة النباتية ذات الأهمية طازجة ، فقم بتجميدها عن طريق وضعها في أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلين وغمرها في النيتروجين السائل لمدة 2-3 دقائق.
  2. ضع الأنسجة النباتية المجمدة في ملاط مبرد مسبقا (في مبرد بوليسترين مع نيتروجين سائل) ، وباستخدام مدقة مبردة مسبقا ، قم بطحن الأنسجة إلى مسحوق موحد.
  3. قم بوزن الكمية المطلوبة من الأنسجة بسرعة في أنبوب طرد مركزي دقيق من مادة البولي بروبيلين باستخدام ملعقة مبردة مسبقا ، وأضف على الفور 20٪ ميثانول (في درجة حرارة الغرفة [RT]) بتركيز 1 مل لكل 100 ملغ من الأنسجة.
    ملاحظة: يستخدم الميثانول (20٪) بشكل شائع لاستخراج TAs25. في بعض الأحيان ، يتم إضافة 0.1 ٪ حمض الفورميك ، على الرغم من عدم ملاحظة أي اختلاف في كفاءة الاستخراج أثناء تطوير هذه الطريقة وغيرها.
  4. ضع الأنابيب المغطاة على شاكر هزاز (سرعة متوسطة) لمدة لا تقل عن 3 ساعات في RT.
  5. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 9464 × ز لمدة 10 دقائق. ماصة من المادة الطافية إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية LC-MS ، أو ، إذا كانت لا تزال غائمة ، قم بالتصفية من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر أولا.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، على الرغم من أنه يجب تخزين عينات ومستخلصات النباتات الطازجة المعالجة في مجمد -80 درجة مئوية قبل التحليل لتجنب أي تدهور قلويد محتمل.

2. تكوين أداة LC-MS وجمع البيانات

تنبيه: الأسيتونيتريل سام وقابل للاشتعال. الابتعاد عن مصادر الاشتعال والتحكم في الأبخرة باستخدام غطاء الدخان. حمض الفورميك أكالة. تجنب ملامسة الجلد والعين وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة.

  1. استخدم أداة LC-MS مع مصدر تأين بالرش الكهربائي (ESI) وعمود HPLC عكسي الطور (C18 ، 4.6 × 100 مم).
  2. بالنسبة ل HPLC ، استخدم 0.1٪ حمض الفورميك في H2O كمذيب A و 0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل كمذيب B ؛ قم بموازنة العمود مع 99٪ A و 1٪ B. قم بتكوين تدرج 30 دقيقة من 1٪ -50٪ B على مدار 26 دقيقة ، والعودة إلى 1٪ B عند 26.01 دقيقة ، مع الاستمرار عند 1٪ B لمدة 4 دقائق. استخدم فرن عمودي بدرجة حرارة 45 درجة مئوية ومعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة.
  3. في طريقة LC-MS ، استخدم معلمات التشغيل التالية لمطياف الكتلة: جهد الواجهة: 4.0 كيلو فولت ، تدفق غاز البخاخات: 3 لتر / دقيقة ، تدفق غاز التسخين: 10 لتر / دقيقة ، درجة حرارة DL: 250 درجة مئوية ، درجة حرارة كتلة الحرارة: 400 درجة مئوية ، درجة حرارة الواجهة: 300 درجة مئوية ، تدفق غاز التجفيف: 10 لتر / دقيقة ، وضغط غاز التفكك الناجم عن الاصطدام (CID) (الأرجون) 17 كيلو باسكال.
  4. قم ببناء طريقة MS في الوضع الإيجابي ESI الذي يتضمن كلا من فحص Q3 وفحص Q1 (100-1000 Da) الذي يعمل كحدث مسح (مضبوط على طول طريقة LC) ، مع تمكين استبعاد النظائر التلقائي. قم بتضمين مسح أيون المنتج كحدث تابع لمسح Q1 (تحليل DD) ، مع نافذة كتلة من 50-1000 Da ، وطاقة خلية تصادم تبلغ -20 فولت ، وزمن حدث يبلغ <0.2 ثانية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون حد العد لتشغيل الفحص الأيوني لمنتج DD في Q1 متغيرا ، ولكن عادة ما يتم استخدام مستوى 7000-10000 عدد. في بعض الأدوات ، مثل تلك المستخدمة لتطوير الطريقة ، يوفر مسح Q3 دقة وحساسية أكبر للكتلة من Q1 ويتم تضمينه لتأكيد الأيونات التي لوحظت في مسح Q1 ، على الرغم من أنه يمكن حذفه من الخطوة 2.4 دون مشكلة.
  5. إلى طريقة MS المذكورة أعلاه ، أضف PrISs ذات الوضع الإيجابي مساوية لطول طريقة LC مع طاقات خلايا التصادم -20 V وأوقات الأحداث 0.75 ثانية. تأكد في جميع الحالات من تمكين وظائف الاستبعاد التلقائي للنظائر أو إزالة النظائر . تأكد من أن قيم m / z ذات الأهمية لشظايا TA (في Da ، انظر الشكل 1A) هي 124.1 (ل TAs أحادية الاستبدال ، نافذة الكتلة من 125-1000 Da) ، 122.1 و 140.1 (ل TAs ثنائية الاستبدال ، نوافذ الكتلة التي تبدأ من 123 و 141 Da ، على التوالي) ، و 156.1 و 138.1 (ل TAs ثلاثية الاستبدال ، نوافذ الكتلة تبدأ من 157 و 139 Da ، على التوالي).
    ملاحظة: أثناء تطوير الطريقة ، تم تقسيم PrIS على طريقتين مختلفتين ، واحدة ل TAs أحادية وثنائية الاستبدال والأخرى ل TAs ثلاثية الاستبدال ، على الرغم من أنه يمكن تقسيمها أو دمجها بأي طريقة.
  6. إنشاء أسلوب MS ثان يتضمن المعلمات في الخطوة 2.4.
    1. إلى طريقة MS / MS هذه ، أضف NLS في الوضع الإيجابي يساوي طول طريقة LC ، مع طاقات خلايا التصادم -20 فولت وأوقات الحدث 0.75 ثانية. تأكد في جميع الحالات من تمكين وظائف استبعاد النظائر التلقائي أو إزالة النظائر .
    2. تأكد من أن كتل الخسارة المحايدة ذات الأهمية للإسترات على TAs (في Da ، انظر الشكل 1B) هي 100.05 (للإسترات المشتقة من حمض tiglic ، نافذة الكتلة 110-1000 Da) ، 60.03 (لمجموعات الأسيتيل ، نافذة الكتلة 100-1000 Da) ، و 166.06 (استرات حمض الفينيل أو حمض المدارات ، نافذة الكتلة 170-1000 Da).
  7. قم بتنزيل طريقة LC-MS وإنشاء ملفات بيانات للعينات ذات الأهمية. بمجرد موازنة عمود HPLC عند 45 درجة مئوية ، قم بتشغيل العينات ذات الأهمية في دفعة أو ملف مشروع مع فراغات مذيب الاستخراج المناسبة بين الأنواع أو أنواع الأنسجة المختلفة. حجم الحقن النموذجي هو 10-20 ميكرولتر.
    ملاحظة: في الأحجام الكبيرة بشكل خاص ، قد يكون كاشف مطياف الكتلة مشبعا. في حالة تشغيل عينات مركزة للغاية ، تأكد من تنظيف مصدر ESI وضبط الجهاز بانتظام. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا بعد جمع جميع البيانات.

3. تحليل البيانات

  1. افحص مخطط كروماتوجرام الأيونات الكلي لعمليات المسح Q1 و Q3 (والمسح الأيوني لمنتج DD) ، ولاحظ الكتلة الأصلية لأي أيونات وفيرة لها ميزات تشبه TA: أ) الكتلة <500 Da لأيون [M + H] + ، عادة ما تكون كتلة زوجية ، ب) r.t.s نموذجي بين 2-22 دقيقة باستخدام طريقة LC أعلاه ، و ج) شظايا من القائمة التالية: م / ض 93 ، 124 ، 142 ، 140 ، 122 ، 138 ، 156 ، 174 ، 110 ، أو 128 دا.
  2. افحص مخطط كروماتوجرام / قناة PrIS ل m / z 124 ، ولاحظ القمم / الأيونات التي ينتج عندها r.t.s (المسجل في الخطوة 3.1) هذا الجزء. انقر فوق المسح الضوئي من خلال الكروماتوجرام بالإضافة إلى فحص أطياف MS / MS الكاملة التي تم الحصول عليها في المسح الأيوني لمنتج DD ، خاصة بالنسبة للأنواع الأقل وفرة.
    ملاحظة: سيكون هناك نوع حقيقي يحتوي على هذا الجزء لإجراء عمليات مسح متعددة ويظهر في كل من عمليات المسح Q1 و Q3 (إذا تم استخدام الأخير). يتم إرفاق جدول بيانات في المعلومات الداعمة (الملف التكميلي 1) للمساعدة في التعليقات التوضيحية.
  3. كرر الخطوة 3.2 مع كروماتوجرام PrIS الأخرى. نظرا لأن كلا من m / z 122 و 140 يشيران إلى TAs ثنائية الاستبدال وكلاهما m / z 138 و 156 يشيران إلى TAs ثلاثية الاستبدال ، افحص هذه الكروماتوجرام / القنوات معا.
  4. افحص مخطط كروماتوجرام / قنوات NLS ل m / z 100 و 60 و 166 ، ولاحظ القمم / الأيونات التي ينتج عندها r.t.s (المسجلة في الخطوة 3.1) هذه الخسائر المحايدة. كما هو الحال مع Pris ، انقر فوق المسح الضوئي عن طريق المسح من خلال مخطط الكروماتوجرام وقارن مع التجزئة التي تم الحصول عليها في المسح الأيوني لمنتج DD ، خاصة بالنسبة للأنواع الأقل وفرة.
  5. باستخدام مزيج من بيانات PrIS و NLS ، بدعم من نتائج المسح الأيوني لمنتج DD ، قم بعمل تعليقات توضيحية مفترضة للقلويدات المرصودة عن طريق إضافة أصغر كتلة تروبان (على سبيل المثال ، 124 أو 122 أو 138) والخسارة المحايدة ثم حساب الكتلة المتبقية المتبقية.
    ملاحظة: المجموعات النموذجية التي تحل محل TAs (وكتلها في Da) هي الهيدروكسيل (18) ، الأسيتيل (60) ، البروبيونيل (74) ، الأيزوبوتيريل (88) ، التيغلويل (100) ، المشبعة tigloyl / 2-methylbutyryl (102) ، أو حمض الفينيل لاكتات / حمض تروبيك (166).
  6. قارن التعليقات التوضيحية للقلويدات بتلك المبلغ عنها في الأدبيات17 وقواعد البيانات (على سبيل المثال ، MoNA)26 لتحديد أنماط استبدال TA التي تم الإبلاغ عنها (والتي يحتمل أن تكون جديدة). بالإضافة إلى ذلك ، استخدم معايير بعض قلويدات التروبان الشائعة (مثل الأتروبين والليتورين والسكوبولامين) المتاحة تجاريا للتأكيد.
  7. للحصول على معلومات هيكلية إضافية للعينات منخفضة الوفرة (قد يلتقط PrIS و NLS أيونات أقل من عتبات الحدث التابع) ، اجمع مسحا أيونيا محددا للمنتج (باستخدام كتلة الاهتمام كأيون سلائف) على عينة أكثر تركيزا.
    ملاحظة: تم تطوير هذه الطريقة على أداة QQQ منخفضة الدقة. بالنسبة لجميع المركبات الجديدة المفترضة ، يجب استخدام أداة MS عالية الدقة للحصول على أطياف كتلة دقيقة.

النتائج

لإثبات فعالية الطريقة ، تم تحليل مزيج قياسي من TAs (10 ميكروغرام / مل لكل من مزيج أسيتيل تروبين / أسيتيل سودوتروبين [أحادي الاستبدال] ، 10 ميكروغرام / مل لكل خليط من اثنين من أيزومرات أنيسودامين [ثنائي الاستبدال] ، جنبا إلى جنب مع هيوسيامين [أحادي الاستبدال] ، ليتورين [أحادي الا?...

Discussion

وعلى الرغم من أن بارامترات الأجهزة المنصوص عليها في البروتوكول تسمح بأداء مرض، فإن الاستخدام الناجح لهذه الطريقة قد يتطلب اهتماما دقيقا بعدة خطوات حاسمة أو تحسينها إلى المستوى الأمثل. في حين أن تدرج مذيب HPLC المقدم في الخطوة 2.2 مناسب بشكل عام لقلويدات التروبان ، فقد يحتا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة أبحاث أعضاء هيئة التدريس (جامعة ميشيغان الشمالية ، الممنوحة ل MAC) ، وزمالة بحثية جامعية (جامعة شمال ميشيغان ، منحت ل JC) ، وقسم الكيمياء. يود المؤلفون أن يشكروا جون بيرغر (NMU) على المساعدة في تحضير الأنسجة النباتية ، وهانا هوكينز (NMU) على صيانة LC-MS والمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والدكتور ريان فورنوالد وطلابه CH 495 (تخليق المنتجات الطبيعية) على إعدادهم لمزيج الأسيتيل تروبين. ويود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور دانيال جونز (جامعة ولاية ميشيغان) على حصوله على أطياف MS/MS عالية الاستبانة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900667HPLC solvent
Argon gasAirGasAR UHP300CID gas
Formic acid, 99% for analysisThermo ScientificAC270480010HPLC additive
Guard column holderRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC column
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments
Liquid nitrogenAirGasNI 180LT22
Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400For making extraction solvent
Microcentrifuge VWR2400-37
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortar Fisher ScientificFB961CFor grinding plant tissues
PestleFisher ScientificFB961MFor grinding plant tissues
Pipette 1000 mLGilson F144059M
Pipette tip 1000 mLFisher scientific02-707-404
Plant tissuesVarious sourcesN/ACan be anything wild or cultivated
Polypropylene conical tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyrene coolerULINES-18312The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC column
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard column
Rocking shakerThemo Scientific11-676-680
Screw thread vial convenience kit (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS autosampler vials
Syringe, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Syringe filter 0.45 µm Avantor/VWR76479-008
Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometryJT Baker9831-03For making extraction solvent
Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometrySigma-Aldrich900687-1LHPLC solvent

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
  3. Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796 (2019).
  4. Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33 (2022).
  5. Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines - 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , 24-28 (2023).
  6. Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
  7. Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
  8. Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
  9. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407 (2022).
  10. Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall'Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
  11. Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H., Prasain, J. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles. , (2012).
  12. Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
  13. Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
  14. Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872 (2017).
  15. Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
  16. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650 (2022).
  17. Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629 (2021).
  18. Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629 (2023).
  19. Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683 (2020).
  20. Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157 (2023).
  21. Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
  22. Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270 (2022).
  23. Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
  24. Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329 (2022).
  25. Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
  26. . MassBank of North America Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024)
  27. Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin - zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
  28. Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
  29. Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
  30. Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
  31. Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
  32. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
  33. Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
  34. Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
  35. Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , (1993).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved