التربية حسب التصميم للأرز الوظيفي باستخدام تقنيات تحرير الجينوم

Summary

يصف البروتوكول تربية أصناف الأرز النشوي المقاوم حسب التصميم باستخدام تقنيات تحرير الجينوم بطريقة دقيقة وفعالة وبسيطة من الناحية الفنية.

Abstract

تواجه الأساليب التقليدية لتربية المحاصيل ، والتي تعتمد في الغالب على الأساليب التي تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة مثل التهجين التقليدي وتربية الطفرات ، تحديات في إدخال الصفات المستهدفة بكفاءة وتوليد مجموعات نباتية متنوعة. على العكس من ذلك ، أدى ظهور تقنيات تحرير الجينوم إلى نقلة نوعية ، مما مكن من التلاعب الدقيق والسريع بجينومات النبات لإدخال الخصائص المرغوبة عن قصد. واحدة من أكثر أدوات التحرير انتشارا هي نظام CRISPR / Cas ، والذي استخدمه الباحثون لدراسة المشكلات المهمة المتعلقة بعلم الأحياء. ومع ذلك ، فإن سير العمل الدقيق والفعال لتحرير الجينوم لم يتم تحديده جيدا في تربية المحاصيل. في هذه الدراسة ، أظهرنا العملية الكاملة لتربية أصناف الأرز المخصبة بمستويات عالية من النشا المقاوم (RS) ، وهي سمة وظيفية تلعب دورا مهما في الوقاية من أمراض مثل السكري والسمنة. شمل سير العمل عدة خطوات رئيسية ، مثل اختيار جين SBEIIb الوظيفي ، وتصميم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNA) ، واختيار ناقل تحرير الجينوم المناسب ، وتحديد طريقة توصيل النواقل ، وإجراء زراعة الأنسجة النباتية ، وطفرة التنميط الجيني وتحليل النمط الظاهري. بالإضافة إلى ذلك ، تم توضيح الإطار الزمني اللازم لكل مرحلة من مراحل العملية بوضوح. لا يعمل هذا البروتوكول على تبسيط عملية التكاثر فحسب ، بل يعزز أيضا دقة وكفاءة إدخال السمات ، وبالتالي تسريع تطوير أصناف الأرز الوظيفية.

Introduction

يعتمد التربية التقليدية على إدخال السمات في المحاصيل أو إنتاج مجموعات نباتية ذات تباين كاف ، الأمر الذي يتطلب مراقبة ميدانية طويلة الأجل^1،2. نظرا لقيود التربية التقليدية ، تم تطوير تقنية تحرير الجينات ، والتي يمكنها تعديل جينوم المحاصيل بدقة للحصول على السمات المرغوبة لمجموعات النباتات³. نظام تحرير الجينات الأكثر استخداما في النباتات هو CRISPR / Cas (Retroed Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / Cas endonuclate المرتبط ب CRISPR) ، والذي يعتمد على نوكلياز داخلي موجه بالحمض النووي الريبي القابل للبرمجة لإنشاء فواصل مزدوجة الخيط المستهدفة (DSBs) ....

Protocol

أجريت الدراسة في شركة Bellagen Biotechnology Co. Ltd في الصين وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري. قبل المشاركة ، تم شرح بروتوكول الدراسة بدقة للمشاركين ، الذين قدموا الموافقة المستنيرة.

1. تصميم sgRNA وناقلات البناء (توقيت 5-7 أيام)

ملاحظة: تم استخدام متجه ثنائي للتعبير عن نظام CRISPR / Cas-SF01²¹. لا يحتوي على أقل من 3 نيوكليوتيدات (nt) غير متطابقة مع الموقع المحتمل خارج الهدف ل sgRNA. يحتاج محول sgRNA إلى استكمال الطرف اللاصق ، والذي يتم إنشاؤه بواسطة هضم إنزيم Bsa I لناقل التحرير. استند اختيار البرنامج إلى الكفاءة العالية والخصوصية ....

النتائج

في هذه الدراسة ، تم عرض الإجراءات الكاملة لتربية الأرز الوظيفي عن طريق تحرير الجينوم للحصول على أصناف مستقرة من أرز النشا المقاومة. قمنا بدمج sgRNA الذي يستهدف SBEIIb في CRISPR / Cas-SF01 (الشكل التكميلي 1) ، وتسلل الأرز باستخدام تحويل Agrobacterium ، وحصلنا على نباتات تول.......

Discussion

في عملية إنشاء نواقل ضربة قاضية قائمة على CRISPR / Cas-SF01 ، يعد الاختيار الدقيق للحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) أمرا محوريا. هذا يستلزم اعتماد التسلسلات التي تظهر كفاءة تحرير عالية مع الحد الأدنى من التأثيرات غير المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، يشتمل توليف البادئات المست.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium