وقد تم اختبار هذا البروتوكول وتحسينه في مختبر الدكتور ديفيد Scadden. يتم توفير التمويل من معهد دانا فاربر للسرطان / مستشفى ماساتشوستس العام أمراض الدم والأورام السريرية برنامج الزمالة.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ تجربة صاروخ موجه من خلال استخراج خلايا لاستخدامها في التجربة. عن هذه التجربة الحالية ونحن مهتمون في معرفة إذا كان صاروخ موجه من نخاع العظم بأكملها إلى محاريب في العظام الطويلة من الحيوانات المتلقي هو مختلف عن خلايا نخاع العظام المستخرجة من الحيوانات مثل WT C57BL/6J (WT) وتلك التي المعدلة وراثيا بالضربة القاضية لمستقبلات Lysophosphatidic 1 (LPAR1) (KO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن نبدأ في التجربة ، وسوف نقوم بجمع المواد التي نحتاجها لهذه التجربة. في مختبرنا يتم تنفيذ جميع تشريح الفأر في غطاء تدفق الصفحي زراعة الأنسجة وخاصة إذا كانت الخلايا المزروعة ستكون في الحيوان المتلقي بدلا من أن تستخدم لتحليل فيفو السابقين. نبدأ بوضع ورقة زرقاء داخل غطاء محرك السيارة. وتشمل الكائنات الأخرى اللازمة زوج من الملقط وزوج من مقص حاد والتي تم تعقيمها ، ومسحات معقمة المتاح مشرط والكحول. وتصدرت مدقة ، الأزرق 50cc ل سنحتاج برنامج تلفزيوني العقيمة المعدلة و6 وحة جيدا ، وقذيفة هاون ، أنبوب مخروطي الشكل وتصفية 70uM المتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ اتخاذ واحد واحد وزن الماوس KO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصرح باستخدامها في هذه الفئران عن طريق الاستنشاق 2 أكسيد الكربون وانخفض بنسبة 70 ٪ ثم في isopropranolol لمدة 5 ثوان. هذه الخطوة إلى منع التلوث من الخلايا في المصالح مع الفراء والفأر بين أيدينا لم يؤد إلى أي حل وسط في الغلة من الخلايا أو نتائج تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تشريح الفئران بدوره باستخدام زوج من مقص وملقط حادة. نبدأ عادة مع الماوس WT كمسألة روتينية. يتم إجراء قص صغير في الجلد البطني من الفأرة التي تغمر البطن ، وامتدت بعد ذلك الجلد باستخدام اليدين. الجلد ويأتي قبالة أطرافه الخلفية بسهولة. ثم يتم استخراج عظم الفخذ والساق مع الحرص على عدم طرد رأس عظم الفخذ وهذا يحتوي على كمية كبيرة من النخاع العظمي. يتم فصل الأطراف العلوية من الجذع والحيوان من خلال تطبيق ببساطة جر لهم مع الحفاظ على الجذع متحركة. هذا يزيل الأطراف العلوية وقطعة واحدة. يتم استخراج ثم العضد من الأطراف العلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع العظام في إزالة PBS المحورة التي تمت إضافة إلى 6 لوحات جيدا. يتم إجراء تعديل في برنامج تلفزيوني عن طريق إضافة 2 مل من مصل الجنين الحرارة المعطل البقري و 2 سم مكعب من 0.5 M EDTA pH8. ثم يتم تصفية هذا الحل من خلال مرشح Nalgene 0.45 أوقية ، ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة شهر على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا بد من تسمية الآبار في لوحة من أجل أن تكون قادرة على تحديد وزن والعظام KO بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة جثث الماوس والتخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع ورقة جديدة في غطاء المحرك ويتم تنظيف العظام باستخدام مشرط المتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع العظام one تنظيف الماوس في وقت واحد في الهاون. يضاف اثنين مل من برنامج تلفزيوني لتعديل هاون وسحق العظام باستخدام مدقة. من المهم أن تفتيت عظام أولا مع 10 الى والحركات جيئة وذهابا من مدقة ثم يطحنون لهم مع حركات دائرية تدويرية. أفعل عادة في اتجاه عقارب الساعة 50 ، ثم 50 حركات عقارب الساعة ، وهلم جرا ، حتى المواد المتروكة في هاون وأبيض اللون ، وإضافته إلى برنامج تلفزيوني تعديل المادة لا تزال بيضاء أو شفافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل مجموعة من حركات دائرية 50 السحق ، ونحن نقل السائل من قذائف الهاون على تصفية 70 أوقية وضعت على رأس أنبوب مخروطي 50 مل. لا تنس أن تضيف 2 مل من برنامج تلفزيوني للهاون بعد كل عملية نقل للتصفية. كنت لا تريد أن تجرب ويطحنون العظام الجافة أو تركها جافة ولأي مدة من الزمن حيث ان هذا سوف يؤدي الى موت الخلايا المبرمج للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في المواد هاون يصبح أبيض ، يتم نقل المواد في تصفية للهاون ويتم تنفيذ مرة أخرى السحق. هذا يضمن أن لا يضيعوا هذه الخلايا في التصفية. وعادة ما يأخذ واحدة أو مجموعتين من الحركات الدائرية تدويري مرة أخرى لجعل هذه المادة في الأبيض هاون في اللون في الوقت الذي استخراج خلايا كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن يتم طرد الحل في أنبوب المخروطية (يرجى تذكر للحفاظ على الخلايا من وزن والفأر KO منفصلة ، وبالتالي سيكون لديك أنبوبين مختلفة (واحدة مع خلايا وزن ، والآخر مع الخلايا KO). جهاز طرد مركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة طاف به ماصات الشافطة منفصلة لكل أنبوب. إضافة 2 سم مكعب من تحلل ACK العازلة لكل بيليه. وينبغي أن يكون هذا المخزن المؤقت تحلل العقيمة. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 8 سم مكعب من تعديل برنامج تلفزيوني على كل أنبوب. يستغرق 10 ماي من كل أنبوب وماصة في بئرين منفصلة في 96 لوحة جيدا. وضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي وزيادة ونقصان في 1200 دورة في الدقيقة لهم لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الأنابيب هي الغزل ، وإضافة 30 ماي من صبغة زرقاء tryphan و 60 من المجاهدين في برنامج تلفزيوني لتعديل كل بئر من 96 لوحة جيدا أن يحمل خلايا الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ماي من هذا الخليط (يرجى مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا) إلى عدادة الكريات وعدد الخلايا في الساحات four الخارجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا في كل عينة لكل مل هو عدد الخلايا عدها بذلك مقسوما 4 و multiplieد ب 100 000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، وإزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي وresuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني بدون المغنيسيوم والكالسيوم أو الجلوتامين بتركيز 20 مليون خلية لكل مل. سيكون لديك على الأرجح حوالي 5 مل من الصوت لوزن وحجم 5 مل للحيوان KO. من هذه الخطوة فصاعدا سنكون باستخدام برنامج تلفزيوني ، لم يتم تعديل برنامج تلفزيوني للبروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل أنبوب الجاذبة ، صبغة تلوين الخلية ، لتحقيق تركيز 5uM النهائي. دوامة فورا لمدة 10 ثانية. احتضان عند 37 درجة لمدة 10 دقائق ، وتجنب التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنابيب مع برنامج تلفزيوني وتدور لمدة 10 دقيقة في 1200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، نضح في وطاف resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني ب 40 مليون خلية لكل مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل المجاهدين في 500 سم مكعب 1 المحاقن مع إبرة 27G (5 المحاقن لوزن الماوس و 5 حقن الفئران لKO). قد يكون من الحكمة أن إعداد 6 المحاقن لكل الفئات. وجود واحد اضافي يمكن أن تساعد على شكل حقن الوريد الذيل الذي نحن بصدد القيام به بعد ذلك يمكن أن تكون خادعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية المحاقن برقائق من أجل الحفاظ على الجاذبة من التفكك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 500 UL من خليط الخلية في كل حيوان المتلقية ؛ (5 لكل فوج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه الحيوانات تحتاج إلى المشع مع 9 غراي تشعيع 4-24 ساعة قبل عملية الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة من الحقن ، والحصاد نخاع العظم من أطرافه الخلفية من كل حيوان المتلقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العملية كما هو موضح أعلاه للمانحين. Resuspend الخلايا من كل حيوان في 1 سم مكعب من برنامج تلفزيوني. الحصول على خلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة على تدفق عداد الكريات LSR الثاني من دينار بحريني أو ما يعادل صك. ويمكن التعبير عن النتيجة كنسبة مئوية أو العدد المطلق للخلايا في النخاع العظمي التي هي ايجابية حلل الجاذبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor.">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li><li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+hematopoiesis.">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li></ol>

صاروخ موجه هو عملية يتم بموجبها خلايا نخاع العظام بما في ذلك الخلايا الجذعية ، والخلايا الاصلية وخلايا متباينة ، طريقها إلى نخاع العظم بعد حقنها في مجرى الدم أو نخاع العظم تجويف من الفئران. كما هو واضح من التعريف ، قد اختار العلماء لدراسة صاروخ موجه من الخلايا الجذعي?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DPBS (Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Valley Biomedical, Inc</td>
<td>BS3033</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5M EDTA (pH 8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boston BioProducts</td>
<td>BM-150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryphan Blue solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc</td>
<td>25-900-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ACK Lysing Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>10-548E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropranolol U.S.P.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vybrant DiD cell-labelling solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>V22887</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vybrant DiI cell-labelling solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>V22885</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

homing of hematopoietic cells to the bone marrow

هو صاروخ موجه الخلايا المكونة للدم الظاهرة حيث زرع قادرين على السفر من وتدبر أو إقامته في نخاع العظام. وتشارك chemomkines المختلفة والمستقبلات في صاروخ موجه من الخلايا الجذعية المكونة للدم. [1 ، 2] هذه الورقة الخطوط العريضة للبروتوكول صاروخ موجه الكلاسيكية المستخدمة في دراسات الخلايا الجذعية المكونة للدم. عموما هذا ينطوي على عزل السكان الخلية التي هومينغ يحتاج إلى التحقيق ، وتلطيخ هذه الفئة من السكان مع صبغة من الفائدة وحقن هذه الخلايا في مجرى الدم من الحيوان المتلقي. وضحى ثم الحيوان المتلقي في وقت محدد مسبقا بعد الحقن ونخاع العظم لتقييم النسبة المئوية أو العدد المطلق للخلايا التي هي ايجابية لصبغ الفائدة. في واحدة من مخططات تجريبية الأكثر شيوعا ، وكفاءة صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم من اثنين من حيوانات مختلفة وراثيا (نوع حيوان البرية والمناظر بالضربة القاضية) ومقارنتها. توضح هذه المقالة بروتوكول الخلايا المكونة للدم صاروخ موجه في إطار مثل التجربة.

Watch this Scientific Journal Video about Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow at JoVE.com

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

توضح هذه المقالة بروتوكول يستخدم لدراسة الخلايا المكونة للدم صاروخ موجه لمطلبهم في نخاع العظام.

صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظام

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

homing-of-hematopoietic-cells-to-the-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biology

29.4K Views.  MGH - Massachusetts General Hospital. توضح هذه المقالة بروتوكول يستخدم لدراسة الخلايا المكونة للدم صاروخ موجه لمطلبهم في نخاع العظام.

Video: Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

العزلة وتحليل الخلايا الجذعية المكونة للدم من المشيمة

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

جيل من نخاع عظام الفئران الخلايا الجذعية المشتقة للاستخدام في 2 الفوتون التصوير

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

العزلة ، تنقيه ، والتمايز من السلائف العظمية من نخاع العظم الفئران

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the proplatelet formation using in vitro-differentiated megakaryocytes; however, there is an increasing evidence that conventional culture systems do not faithfully recapitulate the differentiation/maturation process that takes places inside the bone marrow. In this manuscript, we present an explant method initially described in 1956 by Thi&#233;ry and Bessis to visualize megakaryocytes which have matured in their native environment, thus circumventing potential artifacts and misinterpretations. Fresh bone marrows are collected by flushing the femurs of mice, sliced into 0.5 mm cross sections, and placed in an incubation chamber at 37 &#176;C containing a physiological buffer. Megakaryocytes become gradually visible at the explant periphery and are observed up to 6 hours under an inverted microscope coupled to a video camera. Over time, megakaryocytes change their shape, with some cells having a spherical form and others developing thick extensions or extending many thin proplatelets with extensive branching. Both qualitative and quantitative investigations are carried out. This method has the advantage of being simple, reproducible, and fast as numerous megakaryocytes are present, and classically half of them form proplatelets in 6 hours compared to 4 days for cultured mouse megakaryocytes. In addition to the study of mutant mice, an interesting application of this method is the straightforward evaluation of the pharmacological agents on the proplatelet extension process, without interfering with the differentiation process that may occur in cultures.

Here, we detail the bone marrow explant method, from sample preparation to microscopic slide analysis, to evaluate the ability of megakaryocytes which have differentiated in their physiological environment to form proplatelets.

ديناميات تشكيل الصفائح الدموية من الفأر نخاع العظم الطازج Explants

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...