نود أن نشكر الدكتور ريتش روجرز للحصول على المساعدة الفنية مع تحليلات ومناقشات مطياف الكتلة مفيدة ، والدكاترة. سرقة موريتز ، Ranish جيف ، وحميد Mirzai لإجراء مناقشات مفيدة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومراكز للتميز.

نمو الخلايا وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعمرة واحدة من خلايا BY4742Δarg4Δlys1 بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام 100 مل الغنية إلى OD 600 من البذور ثم 1.0 في الثقافات 1 ثنائية لتر من الخميرة المتوسطة الحد الأدنى (0.17 ٪ النيتروجين الخميرة قاعدة دون سلفات الأمونيوم أو الأحماض الأمينية ، و 0.5 ٪ كبريتات الامونيوم) تحتوي على كاملة مكملة من الأحماض الأمينية ، وتستكمل مع L / 20mg من أرجينين isotopically العادي أو الثقيل (13 C N 4 6 15 ؛ Isotec) ويسين (13 6 15 C N 2 ؛ Isotec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونمت الخلايا لمدة 18 ساعة ، إلى 600 من OD 1.8. فمن الأهمية بمكان أن تذهب من خلال خلايا لا يقل عن 9 الأجيال لتحقيق الإدماج الكامل للنظائر المسمى. كانت العينة ضوء مكعبات ، وغسلها بالماء المعقم ، reseeded الى أوليئات تحتوي على المتوسط ​​(أرجينين العادي isotopically ويسين ، أوليئات 0.2 ٪ (كيماويات سيغما) و 0.5 ٪ توين 40 (سيغما كيماويات)) ، وحفز لمدة دقيقة 85. غلة هذا الضوء isotopically ، فيما يتعلق أرجينين ويسين ، أوليئات - حفز عينة والثقيلة isotopically عينة مرجعية الغلوكوز نمت. </li></ol> تحلل الخلية ، وعزل والتقطير من الببتيدات <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن زجاجة الطرد المركزي. عينات الحصاد بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق. إزالة وسائل الإعلام ونضح السوائل الزائدة. وزن بيليه وزجاجة (لن تسفر عادة بين 1-2 جرام) ثم تجميد فلاش في النيتروجين السائل. إضافة إلى ما يعادل حجم الوزن من بيليه العازلة &quot;طحن&quot; في كريات مجمدة في النيتروجين السائل (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة (PBS ، Gibco) ، و 10 ٪ الجلسرين ، مثبطات الأنزيم البروتيني (أقراص SigmaFAST المانع البروتياز ، سيجما) ووقف مثبطات الفوسفاتيز (الحرارية العلمية )). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد السفينة طاحنة في النيتروجين السائل. انتظر حتى يتوقف غليان النيتروجين السائل. بيليه نقل إلى وعاء الطحن ، مع الكرات المجمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن في 600 دورة في الدقيقة مع حلقة 20 دقيقة 1 ثانية مع عكس الاتجاه لمدة 3 دقائق. اعادة تجميد السفينة طاحنة في النيتروجين السائل. كرر 4 مرات أكثر لمدة 15 دقيقة مجموع الوقت طحن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع grindate مجمدة في الجليد فالكون 50ml أنبوب مكان جاف. المحل في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحل 10ML من اليوريا 8M ، 0.1M بيكربونات الأمونيوم ، ودرجة الحموضة 8.6 0.1M تريس. إضافة 3 مجلدات من اليوريا إلى 1 العازلة حجم grindate المجمدة (على سبيل المثال من 3mls العازلة اليوريا واضاف بيليه إلى 1 غرام مع 1 مل من العازلة PBS). يصوتن الخليط على الفور مع لجنة التحقيق sonicator غيض (2-10 البقول الثانية). الحفاظ على الحافة بالقرب من الجزء السفلي من أنبوب لمنع الرغوة من الحل. يجب أن تذهب فورا إلى grindate الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح lysate بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف لأنابيب نقل جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل قسامة جديدة من تريس 0.5M [2 - carboxyethyl] الفوسفين (TCEP). إضافة إلى نموذج 1:100 في لتركيز نهائي 5mM. احتضان في 37 ساعة : 1 درجة مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ألكلة من cysteines مخفضة. السماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. جعل قسامة جديدة من iodoacetamide 1M. نضع في الظلام (ونحن التفاف أنبوب في احباط). إضافة إلى التركيز النهائي لل20mM. احتضان في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد iodoacetamide مع DTT 20mM من الأسهم 1M في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كمية البروتين مع برادفورد القياسية أو مقايسة BCA (لا توصف). أخذ عينة لتحليلها بواسطة SDS PAGE أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من صحة إدراج النظائر الثقيلة ، واستخدام 100 ميكرولتر من lysate مخفضة والألكيلية. 01:04 تمييع مع DH 2 O ، وإضافة التربسين يصوتن في 50:1 البروتين لالتربسين. هضم لمدة لا تقل عن 4 ساعات ، العينة الجافة بانخفاض في السرعة وبطالة desalt ثم مع الأعمدة Ultramicrospin C18 (الفريق عش). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات العمود مع 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن مع TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend العينة الجافة في TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪. تحميل على العمود. الطرد المركزي في XG 200 ~ أو أدنى من سرعة المطلوبة للتدفق من خلال العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين مع TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مع مرتين مع الأسيتونيتريل ميكرولتر 50 60 ٪ ، TFA 0.1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينة الجافة في سرعة بطالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في 20 عينة حمض الفورميك ميكرولتر 0.1 ٪. تشغيل 2 ميكرولتر على مطياف الكتلة. الاختيار إدراج أرجينين الثقيلة وisotopically يسين بتحول دالتون 10 و 8 في أطياف م / ض منهما. وينبغي إدراج كل من الأحماض الأمينية تكون بين 96 -- 98 ٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج المبالغ المعادلة (ملغ من البروتين) من عينات isotopically الثقيلة والخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 01:04 العينة مع الميثانول 20 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة التربسين في 1:200. يحضن بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن عملية الهضم قد ذهب إلى إنجاز SDS PAGE. تشغيل 2 و 4 ميكرولتر من العينة التهضيم و 8 anد 16 ميكرولتر للهضم التربسين آخر. تصور من قبل تلطيخ Coomassie أن اكتمال عملية الهضم. إذا لم تكن كاملة ، يصوتن العينة لفترة وجيزة مع sonicator غيض التحقيق مرة أخرى مع وهضم التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف عينة عليها في سرعة بطالة. عند إضافة الجافة 200 ميكرولتر من تصفيتها O 2 درهم ودوامة حتى بيليه يذهب الى حل. عينة أسفل الجافة في سرعة بطالة. Resuspend مرة أخرى مع DH 2 O. جفاف العينة مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه في حمض Trifluoracetic 0.1 ٪ (TFA ؛ سيغما). تأكد من أن الرقم الهيدروجيني حوالي 3 باستخدام شرائح الأس الهيدروجيني. إذا لزم الأمر مع يحمض TFA 10 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه خارج أي راسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt العينات على مياه سبتمبر الباكستانية بطالة العمود C18 500 ملغ. لا الزائد هذه الأعمدة. المبلغ الأقصى هو 5 مغ لكنه أفضل قليلا لتحميل أقل. تقسيم العينة بين عدة أعمدة إذا لزم الأمر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات العمود مع أسيتونتريل 5 مل 100 ٪. الطرد المركزي في XG 200 ~ أو أدنى من سرعة المطلوبة للتدفق من خلال العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن العمود مع 5ml TFA 0.1 ٪. تحميل العينة. تدفق جمع وتحميل مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع TFA 5 مل 0.1 ٪. تكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مع 2ml الأسيتونيتريل 60 ٪ ، TFA 0.1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة أسفل الجافة في سرعة بطالة. </li></ol></li></ol> الببتيد التقطير وعزل Phosphopeptides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الببتيدات هي مجزأة على عمود HILIC. نستخدم TOSOH TSK - جل الأميد 4.6 - 80 مم × 25 سم عمود التحليلية مع عمود الحراسة. خذ وقتك مع هذه الخطوة ، تشغيل العمود لمدة 2 ساعة على 90 ٪ وتشغيل ثم اثنين التدرجات فارغة قبل التحميل عينتك. الحمل الأقصى على عمود ويعتقد أن هذا الحجم إلى حوالي العشرين ، ونحن عادة لا يتم تحميلها أكثر من 5 ملغ في التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مذيب أ -- 98 ٪ ACN/0.1 ٪ TFA المذيب ب -- 2 ٪ ACN/0.1 ٪ TFA تحميل في 90 ٪ أكثر من 20 ألف ، 90 ٪ إلى 85 ٪ وهناك ما يزيد على 5 ، 85 ٪ إلى 60 ٪ وأكثر من 40 ألف ، 60 ٪ من ألف إلى 0 ٪ وأكثر من 5 ، 0 ٪ إلى 90 ٪ وأكثر من ألف 5 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معدل التدفق 1ml/min وجمعت الكسور في فترات دقيقة 2 ابتداء من 85 ٪ إلى 60 ٪ والتدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الكسور للحد من عدد من الكسور إلى 10. وسيؤدي على الارجح الى زيادة كسور أكبر تغطية phosphoproteome. </li></ol> إثراء phosphopeptides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إثراء Phosphopeptides به مؤسسات الصحة الأولية لاختيار جل تقارب الحديدي. نحن لدينا راتنج قسامة IMAC لتجنب تكرار تجميد الذوبان. جعل 50 ملل من حمض الخليك 250 ملم ، و 30 ٪ الحل تحميل ACN. إحضار الرقم الهيدروجيني إلى 2.7 مع حمض الهيدروكلوريك. Resuspend الكريات في 500 ميكرو لتر من محلول يتم تحميلها. فحص الحموضة ، وضبط مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو حسب الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewash 200 ميكرولتر من الخرز IMAC في العمود المناسب. علينا استخدام الأعمدة تدور Molbiotec. إضافة 15 ميكروليتر من الطين 50 ٪ (هلام لتحميل الحل) إلى كل جزء ، واحتضان نماذج لمدة 30 &quot;مع نهاية التناوب على النهاية. الحفاظ على تدفق للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات 3 مرات مع الحل تحميل ومرة واحدة مع 500 ميكرولتر تصفيتها درهم 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل الببتيدات مع 2 -- 3 دقائق مع 400 ميكرولتر من 50 ملي نا 2 هبو 4 (8.4 درجة الحموضة) العازلة. نقل إلى قارورة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحمض إلى درجة الحموضة 3 مع 5 ميكرولتر حمض الفورميك بنسبة 100 ٪ ، ومضة التجميد في النيتروجين السائل والمجفف عينة عليها في سرعة بطالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend phosphopeptides في 200 ميكرولتر من TFA 0.1 ٪ و C18 نظيفة كما هو موضح أعلاه. أسفل عينات eluted الجافة في سرعة بطالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الببتيدات في 20 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪. 2 ميكرولتر استخدام مطياف الكتلة في التحليل أو حسب الحاجة. </li></ol> تلاحظ لجزء كبير من هذا البروتوكول سوف تعمل &#39;الأعمى&#39;. ويمكن رصد تحلل الخلية النشاف الغربية والمقايسات برادفورد أو BCA ، ويمكن أيضا أن تكون عملية الهضم التربسين المقررة بسهولة. سوف العمود HILIC أعطى تتبع مشابهة لهذه واحدة ، أو كما يراها الآخرون [1 ، 2] اعتمادا على آلة اللوني السائل الذي يتم استخدامه. ويتم رصد العينات بواسطة مطياف الكتلة ، واختبار العينات الخاصة بك على الأجهزة غير مكلفة مثل LCQs MALDIs أو قبل الذهاب إلى تحليلات التكلفة العالية على دقة عالية الشامل ، وارتفاع آلة القرار. أخيرا إذا كان لك وتجفيف بانخفاض عينة مع حمض فيه ، واستخدام الزجاج.

<ol>
	<li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis.">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li><li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection.">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li><li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway.">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li><li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast.">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li><li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCX/IMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry.">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li><li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques.">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li><li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li><li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS/MS+and+titanium+oxide+precolumns.">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li><li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry.">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li><li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation.">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li><li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+isolation+of+distinct,+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome.">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li></ol>

وهذه الطريقة تؤدي الى تخصيب phosphopeptides التي يمكن تحليلها كميا. ويمكن تغيير عدد من المعلمات في هذا البروتوكول ، ولكن الجانب الأكثر أهمية هو أن نتذكر للحفاظ على الفسفرة الخاص. لا يمكن أن يتحقق إعداد الخلايا لالكمي في عدد من طرق مختلفة ، على سبيل المثال اذا كنت لا تستطيع تس...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isotec&trade; L-Arginine-13C6,15N4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>608033</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isotec&trade; L-Lysine-15N2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>609021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GIBCO&#x2122; Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>70011044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>78420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retsch PM100 Ball Mill Grinder </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>20.540.0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>01.462.0148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultramicrospin C18 column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Nest Group</td>
<td>SUM SS10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT043395</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TOSOH BioSciences</td>
<td>13071</td>
<td>This is the HILIC chromatographic column.</td>
</tr>
<tr>
<td>Guard column 4.6 mm ID x1 cm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TOSOH BioSciences</td>
<td>19021</td>
<td>We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.</td>
</tr>
<tr>
<td>PHOS-Select&trade; Iron Affinity Gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P9740</td>
<td>This is the IMAC resin. Aliquot and store.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantitative phosphoproteomics in fatty acid stimulated saccharomyces cerevisiae

يصف هذا البروتوكول في نمو والتحفيز ، مع أوليئات الأحماض الدهنية ، الثقيلة والخفيفة isotopically خلايا خميرة س. هي الأرض الخلايا باستخدام إجراء cryolysis في كرة مطحنة مطحنة وgrindate الناتجة جلبت الى حل عن طريق solubilization اليوريا. هذا الإجراء يسمح للتحلل الخلايا في دولة غير نشطة عملية الأيض ، والحفاظ على الفسفرة ومنع إعادة توجيه phosphoproteome أثناء تحلل الخلية. بعد التخفيض ، ألكلة ، تربسين هضم البروتينات ، والمحلاة العينات على أعمدة C18 وتعقيد العينة بنسبة تجزئة باستخدام ماء التفاعل اللوني (HILIC). أعمدة HILIC الاحتفاظ تفضيلي الجزيئات المائية التي هي مناسبة تماما لphosphoproteomics. الببتيدات فسفرته تميل إلى أزل في وقت لاحق ملف الكروماتوغرافي من نظرائهم من غير فسفرته. بعد التجزيء ، وأثرى به phosphopeptides يجمد اللوني المعادن ، الذي يعتمد على المسؤول القائم على الانتماءات لتخصيب phosphopeptide. في نهاية هذا الإجراء العينات مستعدون ليتم تحليلها كميا بواسطة مطياف الكتلة.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

وصف إجراء الفسفرة باستخدام كمية cryolysis ، solubilziation اليوريا ، وتجزيء HILIC تخصيب IMAC من الببتيدات فسفرته.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

quantitative-phosphoproteomics-fatty-acid-stimulated-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

10.0K Views.  Institute for Systems Biology. وصف إجراء الفسفرة باستخدام كمية cryolysis ، solubilziation اليوريا ، وتجزيء HILIC تخصيب IMAC من الببتيدات فسفرته.

Video: Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every eukaryotic genome. This process is an important mechanism for generating diversity between and within organisms1-3. The human genome consists of approximately 40% repetitive sequence of retrotransposon origin, including a variety of LINEs and SINEs4. Exchange events between these repetitive elements can lead to genome rearrangements, including translocations, that can disrupt gene dosage and expression that can result in autoimmune and cardiovascular diseases5, as well as cancer in humans6-9.
Exchange between repetitive elements occurs in a variety of ways. Exchange between sequences that share perfect (or near-perfect) homology occurs by a process called homologous recombination (HR). By contrast, non-homologous end joining (NHEJ) uses little-or-no sequence homology for exchange10,11. The primary purpose of HR, in mitotic cells, is to repair double-strand breaks (DSBs) generated endogenously by aberrant DNA replication and oxidative lesions, or by exposure to ionizing radiation (IR), and other exogenous DNA damaging agents. 
In the assay described here, DSBs are simultaneously created bordering recombination substrates at two different chromosomal loci in diploid cells by a galactose-inducible HO-endonuclease (Figure 1). The repair of the broken chromosomes generates chromosomal translocations by single strand annealing (SSA), a process where homologous sequences adjacent to the chromosome ends are covalently joined subsequent to annealing. One of the substrates, his3-&Delta;3', contains a 3' truncated HIS3 allele and is located on one copy of chromosome XV at the native HIS3 locus. The second substrate, his3-&Delta;5', is located at the LEU2 locus on one copy of chromosome III, and contains a 5' truncated HIS3 allele. Both substrates are flanked by a HO endonuclease recognition site that can be targeted for incision by HO-endonuclease. HO endonuclease recognition sites native to the MAT locus, on both copies of chromosome III, have been deleted in all strains. This prevents interaction between the recombination substrates and other broken chromosome ends from interfering in the assay. The KAN-MX-marked galactose-inducible HO endonuclease expression cassette is inserted at the TRP1 locus on chromosome IV. The substrates share 311 bp or 60 bp of the HIS3 coding sequence that can be used by the HR machinery for repair by SSA. Cells that use these substrates to repair broken chromosomes by HR form an intact HIS3 allele and a tXV::III chromosomal translocation that can be selected for by the ability to grow on medium lacking histidine (Figure 2A). Translocation frequency by HR is calculated by dividing the number of histidine prototrophic colonies that arise on selective medium by the total number of viable cells that arise after plating appropriate dilutions onto non-selective medium (Figure 2B). A variety of DNA repair mutants have been used to study the genetic control of translocation formation by SSA using this system12-14.

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

The HO-stimulated translocation assay monitors single-strand annealing following the creation of DNA double-strand breaks at multiple loci in diploid Saccharomyces cerevisiae. This mechanism may model genome rearrangements in somatic cells of higher eukaryotes following exposure to high doses of ionizing radiation.

حفز الكميات وتحليل تشكيل HO - نوكلياز داخلية Translocations الصبغية التي ستراند ، واحدة في التخمير السكيراء الجعوية</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

قياس مرنا تسوس الأسعار<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; استخدام<em&gt; rpb1-1</em&gt; سلالات

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).