نشكر أعضاء الحاليين والسابقين في المختبر روبنشتاين لتوفير بيئة بحثية داعمة ومتحمسة. نشكر ريان T. جيبسون للمساعدة في بروتوكول الأمثل. نشكر كافة Hochstrasser (جامعة ييل) وديتر وولف (جامعة شتوتغارت) للسلالات الخميرة والبلازميدات. نشكر المراجعين المجهولين لدينا لمساعدتهم في تحسين وضوح وفائدة هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة بحثية من جامعة ولاية الفصل الكرة من سيجما كاي لSGW، والمعاهد الوطنية للصحة منح (R15 GM111713) لإقليم شرق المتوسط، وهي جائزة بحوث جامعة ولاية الكرة أسباير لإقليم شرق المتوسط، وصناديق من جامعة ولاية الكرة مكتب نائب مدير الجامعة وقسم الأحياء.

1. الخميرة الفحص النمو لتحديد المسوخ المرشح عيب في تدهور البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل من النوع البري وخلايا الخميرة متحولة مع ترميز البلازميد بروتين غير مستقر تنصهر، في الإطار، إلى إنزيم مراسل التمثيل الغذائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم transformants في 5 مل من الاصطناعية تعريف (SD) الحد الأدنى من المتوسط ​​الذي هو انتقائية لخلايا إيواء جزيئات البلازميد. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها. ملاحظة: بعد الحضانة بين عشية وضحاها، والخلايا في الثقافة قد تكون إما في مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة ولكن ينبغي أن يكون وصلت الحد الأدنى من OD 600 من 0.2. قد تتطلب سلالات الخميرة جدا بطيئة النمو مرات حضانة يلة تعد من واحد، أو تلقيح عدد أكبر من الخلايا، كما تحدد تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ستة أضعاف التخفيفات المسلسل من خلايا الخميرة تحول في العقيمة لوحة 96-جيدا، بدءا من الخلايا المخفف لن OD 600 من 0.2. وضع كل المحولة الخميرة إلى أن يعاير في صف مختلف في لوحة 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل المحولة، وحساب حجم الثقافة بين عشية وضحاها المطلوبة لتمييع الخلايا إلى OD 600 من 0.2 في الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. إضافة هذا الحجم من الثقافة بين عشية وضحاها إلى المقابلة بشكل جيد في العمود 1. إضافة كمية مناسبة من الماء المعقم لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل صف من الخميرة، إضافة 125 ميكرولتر من الماء المعقم إلى الآبار في الأعمدة 2 و 3 و 4. ملاحظة: قد يتم تعبئتها ملفوفة بشكل فردي معقمة لوحات 96-جيدا مع أغطية معقمة. ويمكن استخدام الأغطية كمخازن للمياه معقمة التي يتم توزيعها في هذه الخطوة. وهذا يسمح نقل في وقت واحد من الماء المعقم لجميع الآبار في عمود معين مع pipettor الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط محتويات العمود الأول (الخميرة المخفف إلى OD 600 من 0.2) من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع pipettor الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfإيه 25 ميكرولتر من الخميرة من العمود 1 إلى العمود 2، وذلك باستخدام pipettor الأقنية. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. نقل 25 ميكرولتر من العمود 2 إلى العمود 3، و 25 ميكرولتر من عمود إلى عمود 3 4 (يمزج جيدا في كل خطوة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط كل عينة مع pipettor الأقنية. وانطلاقا من معظم مخفف إلى الأقل يخفف أعمدة من الخميرة، وماصة 4 ميكرولتر من كل عينة على اثنين من لوحات تحتوي على وسيلة انتقائية المناسب. استخدام لوحة واحدة مع المتوسطة التي تحافظ على اختيار بلازميد (تخدم هذه اللوحة بمثابة اكتشاف الخميرة والسيطرة النمو). استخدام لوحة الثانية مع المتوسط ​​أن يختار لصيانة بلازميد والتعبير عن بروتين غير مستقر تنصهر إلى إنزيم مراسل. لأن الخميرة تستقر بسرعة، ومزيج الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا على فترات منتظمة. ملاحظة: سوف جفافا لوحات تمتص بسهولة أكثر سيولة من الطازجة لوحات، وبالتالي ينصح لهذه التجارب. قد يكون المجفف لوحات رطبة من قبل حضانة في درجة حرارة الغرفة في لوالرطوبة ث ل1 - 2 أيام أو حضانات أقصر في غطاء تدفق الصفحي. لوحات قد يجف بشكل غير متساو إذا كان تدفق الهواء صفائحي موازية للمقاعد البدلاء. استخدام قالب يجعل من السهل على الفور خلايا الخميرة على مسافات منتظمة. وتقدم اثنين من عينة القوالب في الشكل 1، وهذه قد تكون طباعة، قطع، واضافته إلى داخل طبق بتري غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لوحات لتجف على أعلى مقاعد البدلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 2 - 6 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصوير كل لوحة بعد الحضانة. </li></ol><img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> الشكل 1. قوالب لاكتشاف خلايا الخميرة على لوحات أجار 100 ملم. ويمكن استخدام هذه القوالب لتسهيل اكتشاف الخميرة على مسافات منتظمة مع pipettor الأقنية. قد تتم طباعة القوالب، وقطع بها، واضافته الى داخل طبق بتري غطاء. وضع طبق بتري مع النموغطاء داخل متوسطة مع قالب الملصقة. وتتميز القوالب مع الشق لتتبع التوجه. فمن المستحسن أن لوحات تستخدم في فحوصات النمو يتم وضع علامة بالمثل مع الشق لتتبع التوجه. قوالب لاكتشاف أربعة (A) أو خمسة (B) يتم توفير التخفيفات المسلسل من خلايا الخميرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة قابلة للطباعة من هذا الرقم مع قوالب 100 ملم.</a> 2. تأكيد البيوكيميائية دمغ المصوغات نمو الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نمو خلايا الخميرة وبعد القلوية البروتين استخراج (معدلة من 31) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل من النوع البري وخلايا الخميرة متحولة مع ترميز البلازميد بروتين غير مستقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم transformants في 5 مل من SD المتوسطة التي هي انتقائية لخلايا إيواء جزيئات البلازميد. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من كل متر مكعب بين عشية وضحاهاlture. ملاحظة: بعد الحضانة بين عشية وضحاها، قد تكون الخلايا في أي مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة ولكن ينبغي أن يكون وصلت إلى OD 600 من شأنها أن تسمح التخفيف إلى OD 600 من 0.2 في 10 مل المتوسطة انتقائية جديدة (الخطوة 2.1.4). قد تتطلب سلالات الخميرة جدا بطيئة النمو مرات حضانة يلة تعد من واحد، أو تلقيح عدد أكبر من الخلايا، كما تحدد تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع خلايا الخميرة إلى OD 600 من 0.2 في 10 مل المتوسطة انتقائية الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في احتضان خلايا في 30 درجة مئوية، بالتناوب أو الهز، وحتى الثقافات التوصل الى OD 600 بين 0.8 و 1.2 (أي هي في نمو منتصف لوغاريتمي). ملاحظة: إذا كان البروتين غير مستقر من الفائدة هو تحت سيطرة أحد المروجين regulatable، قد تختلف التوقيت الأمثل للتحريض التعبير البروتين والحصاد خلية وفقا لدراسات السابقة أو الملاحظات التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 2.5 OD 600 وحدة الثقافة في 15 مل مخروطيآل أنبوب بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. ملاحظة: واحد OD يعرف 600 وحدة كما كمية الخميرة موجودة في 1 مل من ثقافة في OD 600 من 1.0. حجم الثقافة (في مل) المطلوبة لحصد 2.5 OD 600 وحدة (V) ​​يمكن تحديد باستخدام المعادلة التالية: V = 2.5 OD 600 وحدة / OD قياس 600 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 1 مل الماء المقطر. نقل خلايا علقت لأنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 6،500 x ج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر الماء المقطر pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل، وإضافة 100 ميكرولتر 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. احتضان عينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا بيليه (معظمها لم يصدر بعد البروتينات ولا تزال قابلة للحياة) بواسطة الطرد المركزي عند 18،000 العاشرز لمدة 5 دقائق. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه resuspend في 50-100 ميكرولتر 1X Laemmli عينة العازلة، والتي سوف ليز الخلايا، من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل. ملاحظة: إزالة طاف القلوية التالية الطرد المركزي وإعادة تعليق لاحق من الخلايا في Laemmli عينة عازلة استخراج البروتينات في الرقم الهيدروجيني متوافقة مع دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE) باستخدام نظام تشغيل عازلة تريس، جليكاين والنشاف الغربي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتفسد تماما البروتينات، واحتضان لست] في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قد تصبح البروتينات تجميع المعرضة لل(مثل البروتينات مع عدة قطاعات عبر الغشاء) غير قابلة للذوبان عندما حضنت في 95 ° C: ملاحظة. ولذلك، ينبغي المحتضنة لست] في درجات حرارة منخفضة (على سبيل المثال 37 ° C - 70 ° C) لمدة 10 - 30 دقيقة، كما تحدد تجريبيا، لتحليل هذه البروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لست] باردة عن طريق وضع على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لست] الطرد المركزي في 18،000 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. فصل طاف (يذوب البروتين المستخرج) من خلال SDS-PAGE قبل لاحق تحليل لطخة الغربي (القسم 2.2). بدلا من ذلك، لست] تخزينها في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول النشاف الغربي تمثيلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل حجم تصميما تجريبيا لللست] في جل SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام في 200 V حتى صبغ الجبهة وصلت إلى الجزء السفلي من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتينات من هلام لفلوريد البولي فينيل (PVDF) الغشاء عن طريق التحويل الرطب في 20 V لل60-90 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة غشاء التي تفرخ في 5٪ الحليب الخالي من الدسم في تريس مخزنة المالحة (TBS)، هزاز، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب عرقلة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين من الفائدة (أو علامة حاتمة منها) في 1٪ الحليب الخالي من الدسم في TBS مع 0.1٪ توين-20 (TBS / T) لمدة 1 ساعة في غرفة الشركة المصرية للاتصالاتmperature، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل الأجسام المضادة، وغسل غشاء 3 × 5 دقائق مع TBS / T في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع fluorophore مترافق المناسب الضد الثانوية في 1٪ الحليب الخالي من الدسم في TBS / T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، هزاز. ملاحظة: لأن fluorophores حساسة للضوء، ينبغي إعداد التخفيفات من الأجسام المضادة fluorophore مترافق في الظلام. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يحدث حضانة الأغشية في وجود الأجسام المضادة fluorophore مترافق في حاويات lightproof. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق لف صواني الحضانة في رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل الأجسام المضادة، وغسل غشاء 3 × 5 دقائق مع TBS / T في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة غشاء باستخدام لى كو أوديسي CLX والبرمجيات صورة استوديو (أو معدات التصوير المماثلة والبرمجيات)، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير الغشاء، واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة لتحميلالبروتين السيطرة جي في 1٪ الحليب الخالي من الدسم في TBS / T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل الأجسام المضادة، وغسل غشاء 3 × 5 دقائق مع TBS / T في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع fluorophore مترافق المناسب الضد الثانوية في 1٪ الحليب الخالي من الدسم في TBS / T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل الأجسام المضادة، وغسل غشاء 3 × 5 دقائق مع TBS / T في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة غشاء باستخدام لى كو أوديسي CLX والبرمجيات صورة استوديو (أو معدات التصوير المماثلة والبرمجيات)، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. </li></ol></li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

منهجية المقدمة هنا تسمح لتحديد السريع وتأكيدا الكيمياء الحيوية من متطلبات الجينية للتدهور البروتين في خلايا الخميرة. هذه التجارب تبرز فائدة وقوة الخميرة على أنها كائن وحيد الخلية نموذج (عدة مراجعات ممتازة من الخميرة البيولوجيا ومصنفات من بروتوكولات لمناولة وتخزين...

تدهور البروتين انتقائية ضروري للحياة حقيقية النواة، ويسهم تدهور البروتين تغير لعدد من الحالات الطبية، بما في ذلك عدة أنواع من السرطان وأمراض الاعصاب وأمراض القلب والأوعية الدموية، والتليف الكيسي 1-5. النظام اليوبيكويتين-proteasome و(UPS)، والذي يحفز تدهور البروتين انتقائية، هو الهدف العلاجي الناشئة عن هذه الظروف 6-10. ligases اليوبيكويتين نعلق تساهميا البوليمرات من حمض اليوبيكويتين 76-الأمينية إلى بروتينات 11. يتم التعرف على البروتينات التي تم تحديدها مع سلاسل polyubiquitin وبروتين محلل من قبل ~ 2.5 megadalton 26S proteasome و12. وكانت الدراسات التي بدأت في كائن وحيد الخلية نموذج خميرة الخباز (مهدها الخميرة) التأسيسي في توضيح آليات تدهور البروتين في الخلايا حقيقية النواة. وكانت أول الركيزة الفسيولوجية أثبتت من UPS الخميرة قامع النسخي MATα2 13، تم تحديد أول 14، والعديد من المكونات حفظا للغاية من UPS أو تتميز في الخميرة (على سبيل المثال 15-26). الاكتشافات التي تمت في هذا النموذج الحي تنوعا ولين العريكة وراثيا من المرجح أن تواصل تقديم نظرة ثاقبة على آليات الحفاظ عليها من التدهور بوساطة اليوبيكويتين. الاعتراف وتدهور معظم ركائز UPS تتطلب اتخاذ إجراءات متضافرة من البروتينات متعددة. ولذلك، هدفا هاما في وصف تدهور المنظم للبروتين غير مستقر معين هو لتحديد متطلبات الوراثية لالتحلل البروتيني. النهج الكلاسيكية (مثل نبض مطاردة والتجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة 27) لرصد تدهور البروتين في خلايا الثدييات أو الخميرة هي شاقة وتستغرق وقتا طويلا. في حين أن هذه الأنواع من منهجية توفر وسيلة حساسة للغاية للكشف عن تدهور البروتين، فهي ليست مناسبة للتحليل السريع للتدهور البروتين أو على نطاق واسع screeniنانوغرام للطفرات التي تمنع تدهور البروتين. هنا، يتم تقديم مقايسة على أساس نمو الخميرة لتحديد السريع لمتطلبات الوراثية لتحلل البروتينات غير مستقرة. في طريقة أساس نمو الخميرة لتحليل تدهور البروتين، وهو بروتين غير مستقر من الفائدة (أو إشارة تدهور) وتنصهر، في الإطار، إلى البروتين ما هو مطلوب لنمو الخميرة تحت ظروف معينة. والنتيجة هي الركيزة الاصطناعية التي قد تكون بمثابة أداة قوية لتحديد متطلبات الوراثية من تدهور البروتين من بروتين غير مستقر في المصالح. ملائم، الأكثر استخداما سلالات الخميرة مختبر تؤوي لجنة من الطفرات في الجينات التي تكود الإنزيمات الأيضية تشارك في التركيب الحيوي معينة من الأحماض الأمينية أو القواعد النيتروجينية (على سبيل المثال 20،28-30). هذه الإنزيمات ضرورية لانتشار الخلوي في غياب المقدمة خارجيا الأيض في التوليف الذي الإنزيمات تشارك. مثلوبالتالي قد الإنزيمات الأيضية تعمل كما صحفيين القائم على النمو لتحلل البروتينات غير المستقرة التي تنصهر فيها. متطلبات الجينية للتدهور البروتين يمكن توضيح بسهولة، لأن الطفرات التي تمنع التحلل البروتيني سيسمح خلايا إيواء مراسل تدهور في النمو في ظل ظروف انتقائية. وهناك ميزة النمو وهذا مؤشر غير مباشر أن طفرة معينة تزيد من وفرة من البروتين من الفائدة. ومع ذلك، مطلوب تحليل الكيمياء الحيوية المباشر للتأكد من أن طفرة تسمح النمو من خلال زيادة مستويات البروتين وليس عن طريق أسباب غير مباشرة أو مصطنعة. ويمكن تأكيد تأثير طفرة على وفرة البروتين عن طريق تحليل لطخة الغربي من مستويات البروتين الحالة المستقرة في الخلايا التي تفعل وليس لإيواء طفرة معينة. وهناك طريقة لاستخراج السريع والفعال للبروتينات الخميرة (حضانة متتابعة من خلايا الخميرة مع هيدروكسيد الصوديوم وعازلة عينة) في شكل مناسبلتحليلها من قبل النشاف الغربي ويقدم أيضا 31. معا، وهذه التجارب تسهيل التعرف السريع على المنظمين مرشح للتدهور البروتين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#39;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#39;s laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC264571000</td>
			<td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088726001</td>
			<td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-32</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>51028068</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-0450</td>
			<td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14403</td>
			<td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14401</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate imaging system (e.g. 
			Gel Doc XR+ System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8195</td>
			<td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Dri-Bath Heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1172011AQ</td>
			<td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>459250</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

تدهور البروتين المنظم هو أمر حاسم لتقريبا كل وظيفة الخلوية. تأسست بكثير من ما هو معروف عن الآليات الجزيئية ومتطلبات الوراثية للتدهور البروتين وحيد الخلية في البداية في خميرة الخباز. وقد اعتمدت التحليلات الكلاسيكية للتدهور البروتين على نبض مطاردة وسيكلوهيكسيميد مطاردة منهجيات البيوكيميائية. بينما توفر هذه التقنيات الوسائل الحساسة لمراقبة تدهور البروتين، فهي شاقة، تستغرق وقتا طويلا، وانخفاض الإنتاجية. هذه الأساليب ليست قابلة للفحص السريع أو على نطاق واسع للطفرات التي تمنع تدهور البروتين. هنا، يتم وصف مقايسة على أساس نمو الخميرة لتحديد سطحي من متطلبات الجينية للتدهور البروتين. في هذا الاختبار، وتنصهر إنزيم مراسل المطلوبة للنمو في ظل ظروف انتقائية محددة لبروتين غير مستقر. خلايا تفتقر إلى إنزيم مراسل الذاتية ولكن تعبر عن انصهار بروتين يمكن أن تنمو تحت سيليشروط التفاعلية الذي نظمه فقط عندما يستقر البروتين الانصهار (أي عندما تتعرض للخطر تدهور البروتين). في مقايسة النمو وصفها هنا، ورصدت التخفيفات المسلسل من النوع البري وخلايا الخميرة متحولة إيواء ترميز البلازميد بروتين الانصهار على المتوسطة انتقائي وغير انتقائي. النمو في ظل ظروف انتقائية يتسق مع تدهور ضعف عن طفرة معينة. وينبغي تأكيد زيادة وفرة البروتين كيميائيا. ويتجلى أيضا هناك طريقة لاستخراج السريع للبروتينات الخميرة في شكل مناسب لالكهربائي والنشاف الغربي. هناك قراءات والقائم على النمو للاستقرار البروتين، جنبا إلى جنب مع بروتوكول بسيط لاستخراج البروتين لتحليل الكيمياء الحيوية، ويسهل التعرف السريع على متطلبات الجينية للتدهور البروتين. هذه التقنيات يمكن تكييفها لمراقبة تدهور مجموعة متنوعة من البروتينات قصيرة الأجل. في المثال المقدمة، الانزيم HIS3، وهو مطلوب لالحامض الاميني الحيوي، وتنصهرلDeg1 يستهدف -Sec62. Deg1 -Sec62 للتدهور بعد أن يشرك aberrantly شبكية هيولي باطني translocon. كانت خلايا إيواء Deg1 -Sec62-HIS3 قادرة على النمو في ظل ظروف انتقائية عندما استقرت البروتين.

لتوضيح هذه المنهجية، وقد تنصهر الإنزيم HIS3 إلى محطة-كربوكسي من طراز الشبكة الإندوبلازمية (ER) تدهور -associated (ايراد) الركيزة، Deg1 -Sec62 (الشكل 2A) لإنشاء Deg1 -Sec62-HIS3 (الشكل 3) . يمثل Deg1 -Sec62 أحد الأعضاء المؤسسين لفئة جديدة من ركائز ايراد التي تستهدف ...

Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.6K Views.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Video: Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.