الكتاب نود أن نشكر الدكاترة. Philina س. لي وألان غروسمان دال للتدريب في البداية في LAS المجهري مضان. الكتاب أيضا أن أشكر الدكاترة. ميلاني Berkmen كوباياشي وهاجيمي طلبا للمساعدة ونصائح للتصوير. وأيد هذا العمل عن طريق بدء الأموال من كلية الآداب والعلوم والآداب والعلوم من قسم علم الأحياء الجزيئية والخلوية والتنموية في جامعة ميشيغان.

تزايد الثقافات من الخلايا للفحص المجهري 1. واحد أو يومين قبل التصوير ، وإعداد B. سلالة الرقيقة التي تحتوي على البروتين الانصهار متعدية كنت ترغب في تصور. سوف جولات محاكمة 1A 1B الخطوات وتكون ضرورية لتحديد حالة النمو التي توفر أفضل الصور من سلالة الخاص بك. في معظم الحالات ، ينبغي تصوير الخلايا خلال مرحلة النمو المتسارع. <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة لبعض B. سلالات الرقيقة (في السلالات ، ولا سيما التي تنمو بشكل سيئ نتيجة لاندماج بين الانصهار متعدية الجينات في المصالح وGFP في مكان به الذاتية) ، والنمو الأولي لمدة يومين قبل التصوير ضروري للصور ذات جودة عالية. في اليوم الأول ، على خط باء الرقيقة إلى سلالة يمكن تصوير أغار على LB مع المضادات الحيوية الانتقائية (ق) ، واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، تطعيم 100 ميكرولتر من المياه المالحة 0.85 ٪ مع مستعمرة واحدة وأداء ثلاث التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف على لوحات أجار LB (مع المضادات الحيوية الانتقائية) ، والطلاء 100 ميكرولتر من كل التخفيف ، وتليها الحضانة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في اليوم الثالث ، حدد لوحة التخفيف مع النمو متموجة ضوء الخلايا. وسيكون معدل النمو متموجة الضوء على طبق تقديم المتوسطة النمو مع قيحة صحية ، وبدء تزايد أضعافا مضاعفة العائد المحتمل نتائج التصوير الممتاز (راجع الخطوة 4). هذه الخطوة هي مفيدة بشكل خاص للتصوير بجودة أعلى الغشاء مع 64 FM4 وصمة عار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باء أخرى ببساطة قد الرقيقة سلالات انتقائية تطبق على LB المتوسطة أغار على المستعمرات واحدة بعصا العقيمة في اليوم قبل التصوير واحتضان ليلا 30 درجة مئوية. في اليوم التالي ، والخلايا على هذا الطبق يكون كافيا لاستخدامها كعامل قيحة للتصوير (راجع الخطوة 4). ملاحظة : للحصول على B. الرقيقة والثقافات بين عشية وضحاها في المتوسط ​​السائل ليست مناسبة بسبب وجود مزيج من تشكيل بوغ والاستجابات النصاب القانوني ، والذي يؤدي لفترة طويلة من النمو مرحلة متخلفة 1. </li></ol> 2. في صباح يوم من التصوير ، ووضع 10 مل من المتوسط ​​50 S7 1-3 في قارورة 125 مل مخروطي العقيمة. 3. Resuspend الخلايا في لتصل إلى 2 مل من المتوسط ​​من 50 S7 LB طبق آغار مع واحد أو مستعمرات الخلايا ضوء متموجة للحصول على اللقاح. 4. إضافة ما يكفي من S7 50 خلية متوسطة قيحة إلى دورق مخروطي يحتوي على 10 مل 50 S7 المتوسطة لثقافة ذات الكثافة الضوئية الأولي تقاس في 600 نانومتر (OD 600) من ~ ،08-،1. في هذه الخطوة من المهم أن يكون ما لا يقل عن 10 الهواء أضعاف لتصل إلى نسبة متوسطة. وبالتالي ، فإننا نستخدم 10-12،5 مل من المتوسط ​​تلقيح في دورق مخروطي 125 مل. 5. تنمو كل ثقافة في 30 درجة مئوية حتى يصل إلى ثقافة OD 600 ~ 0،5-0،8. ويفضل حمامات المياه تهتز مع الثورات في الدقيقة الواحدة 150-200. وينبغي أن الثقافات تحدى مع وكلاء حمل الحمض النووي تلف أو عدم تطابق تكون في مرحلة النمو المتسارع في وقت مبكر من هذا القبيل 600 OD أن الخلايا ستصل إلى الهدف OD 600 مع الفترة الإضافية للنمو المطلوب للعلاج (انظر الجدول رقم 1) على سبيل المثال ، 2 - aminopurine يتطلب ساعة واحدة من العلاج ، ولذا تعامل مع ثقافة aminopurine - 2 ينبغي أن تكون في OD 600 ~ 0،3-0،4 ، على ان يكون ساعة واحدة من العلاج / نتائج النمو في OD 600 ~ 0،5-0،8 ، حيث الخلايا جاهزة للتصوير. تحضير العينة 1. ماصة 300 ميكرولتر من الخلايا المستزرعة في أنبوب مل microcentrifuge 1.5. 2. إذا كان المطلوب تصوير الأغشية الخلوية ، إضافة 1:1000 تخفيف FM4 - 64 غشاء صمة عار (Invitrogen) لكل عينة من حل سهم 1 ملغ / مل. قد تكون هناك حاجة لمعايرة 64 FM4 لتحقيق إشارة مضان المطلوب. مجموعة المعايرة النموذجية 1:100 ، 1:1000 ، و1:10،000. 3. السماح لعينات من الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى عشر دقائق أو حين يجري إعداد الشريحة مع agarose 1 ٪ في المتوسط ​​Spizizens 1X كما هو موضح أدناه (راجع الخطوة 1 من &quot;إعداد الشرائح&quot;). 4. إذا كان المطلوب التركيز من الخلايا ، ونحن نفضل تصفية الخلايا باستخدام ميكرومتر 0.2 فلتر مع جهاز فراغ. ويمكن عندئذ أن تغسل الخلايا بلطف من سطح المرشح مع برنامج تلفزيوني ، آخر العازلة المناسبة أو متوسطة قبل التصور. إعداد الشريحة 1. إعداد agarose 1 ٪ مع 1X Spizizens. إضافة 5 مل من الأسهم لddH2O Spizizens 10X 45 مل مع agarose ز 0.5 ، والميكروويف لتذوب. agarose المنصهرة الساخنة يصعب ماصة ، وطدت agarose لن تدخل طرف ماصة. ينبغي أن يكون agarose معايرتها في حمام الماء إلى درجة حرارة من 55-65 درجة مئوية ~ لكي تدخل طرف ماصة دون ترسيخ داخل<html> الحافة. 2. رسم ميكرولتر من 20 Spizizens مع agarose ذاب 1 ٪ في تلميح ماصة. ماصة قطرة واحدة (حوالي 1-2 ميكرولتر) من الحل agarose في كل شريحة جيدا (15 نستخدمها بشكل جيد الشرائح ، انظر الجدول رقم 2) لتشكيل منصات agarose الضحلة. سوف يصلب agarose على الفور. ويجب أيضا أن يتم قبل الشرائح فورا إلى تطبيق الخلايا. إذا ترك وسادات agarose في درجة حرارة الغرفة وحدها ، فإنها يمكن أن يذوى في غضون دقائق وتصبح غير صالحة للاستعمال. وينبغي أن تتركز منصات Agarose وملء كل بئر ولكن ارتفاع الحد الأدنى لتجنب تعطيل ساترة ، وإذا قطرات مرتفعة جدا (مثل فقاعة) أو إذا كان نموذج ينتشر ما وراء الحدود بشكل جيد ، انتقد ببساطة نظيفة بشكل جيد مع Kimwipe وتطبيق منصة جديدة agarose. 3. تطبيق كامل 300 عينة ميكرولتر (راجع الخطوة 6) إلى الشريحة ، وزعت على رأس كل وسادة agarose. وينبغي أن هذا المبلغ من الخلايا تكون كافية لتغطية كل بئر على الشريحة. 4. السماح للشريحة محملة الخلايا على الجلوس في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) لنحو عشر دقائق. وهذه الخطوة تسمح للخلايا ليستقر على منصة متحركة وagarose تصبح جاهزة للتصوير. لتلبية الاحتياجات المتخصصة درجة الحرارة هذه قد تحتاج إلى تغيير ، على سبيل المثال ، عند إجراء التجارب التي تتطلب تحولا في درجة الحرارة 4. 5. نضح بعيدا المتوسطة الزائدة من كل جانب دون إزالة منصات أنفسهم. 6. تطبيق ساترة إلى الشريحة ، والضغط بقوة وبشكل متساو ، ولكن بلطف ، وعبر مساحة الشريحة. تحقق للتأكد من أن تنزلق الغطاء ضد الشريحة والتي لم يتم رفع الغطاء ينزلق فوق الشريحة. التصور من الخلايا 1. فإن العديد من المجاهر مضان مختلفة تعمل بشكل جيد. فمن الأهمية بمكان أن يكون الانغماس النفط 100X العدسة. يستخدم مختبر سيمونز : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اوليمبوس BX61 المجهر مجهزة 1،45 NA النفط 100X TIRFM عدسة الهدف الغمر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبريد هاماماتسو ORCAR 2 كاميرا CCD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجويف معدني قوس 200 (قبل) مصدر الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن GFP (FITC) ، تصفية الإثارة وانبعاث 460-500 510-560 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن 64 FM4 (TRITC) ، 510-560 تصفية الإثارة وانبعاث 572-648. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم القبض على الصور باستخدام SlideBook 4.2 (الشكل 1) </li></ul> 2. جعل الخلايا في التركيز باستخدام الضوء الأبيض. 3. التقاط الصور باستخدام المرشحات المناسبة لكل fluorophore. ممثل النتائج وتظهر الصور ممثل (الشكل 1). وينبغي أن تحدد بؤر GFP جيد ، في حين FM4 - 64 تلطيخ ينبغي أن يكون مشرقا وواضحا 4-7. يمكن GFP أو الغشاء تكون الصور الملونة الزائفة مع أي لون ، للسماح للصورة عالية الجودة لتقديمها دون فقدان أية بيانات. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : صور الممثل GFP باء وترد الرقيقة البروتينات الانصهار متعدية. البروتينات GFP باللون الأخضر ، في حين أظهرت تلطيخ FM4 غشاء - 64 باللون الأحمر. شريط النطاق الأبيض يشير 3 ميكرومتر (A) MutS - GFP [الوراثي ذات الصلة : mutS -- GFP (SPC) ، amyE : Pspac mutL (القط)]. في وجود 600 ميكروغرام / مل 2 و 1 aminopurine IPTG ملم. لم يتم تقديم FM4 - 64 في إشارة إلى النظام أكثر وضوحا تظهر بؤر MutS - GFP (B) MutL - GFP [الوراثي ذات الصلة : mutL : mutL - GFP (SPC)].. في وجود aminopurine - 2 (C) DnaX - GFP [الوراثي ذات الصلة : dnaX : dnaX - GFP (SPC)]. (D) RecA - GFP [الوراثي ذات الصلة : recA : recA - GFP (SPC)] في وجود من 20 نانوغرام / مل mitomycin C. (E) - TagC GFP [الوراثي ذات الصلة : tagC : tagC - GFP (SPC) ] في وجود من 1 ميكروغرام / مل جيم mitomycin <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المعاملة / الاعتقال أو مقدار </td><td> وظيفة </td><td> وقت الحضانة </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20-150 نانوغرام / مل] </td><td> الحمض النووي عامل مؤلكل </td><td> 1 ساعة </td></tr><tr><td> 2 - aminopurine (2 - AP) [600 ميكروغرام / مل] </td><td> تطابق حمل </td><td> 1 ساعة </td></tr><tr><td> هيدروكسي يوريا (HU) </td><td> يستنزف dNTPs </td><td> 3 ساعات </td></tr><tr><td> الأشعة فوق البنفسجية (UV) 20 J/m2 </td><td> الثايمين ، والثايمين dimers برومة 6-4 </td><td> تختلف تبعا للمصدر ، وعادة 20 ثانية </td></tr><tr><td> الرمادي (الإشعاع المؤين) 5-100 غراي </td><td> فواصل حبلا مزدوجة ، فواصل حبلا واحدة وقاعدة الضرر المواقع </td><td> تختلف تبعا للمصدر </td></tr></tbody></table>&quot;&gt; الجدول 1. ملخص من الحمض النووي الضارة والعلاجات إحداث تطابق <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> Multitest الشريحة ، كذلك 15 </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> مجهر غطاء زجاج </td><td> الصياد </td><td> 12-544 - B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> الصياد </td><td> BP160 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> سيغما </td><td> M0503 - 2MG </td><td> المغير ، والقفازات ارتداء </td></tr><tr><td> 2 - Aminopurine </td><td> سيغما </td><td> A3509 - 250MG </td><td> قفازات </td></tr><tr><td> هيدروكسي يوريا </td><td> سيغما </td><td> H8627 - 25G </td><td> قفازات </td></tr><tr><td> FM4 - 64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> ضوء حساسية </td></tr></tbody></table> الجدول 2. قائمة محددة من الكواشف والمعدات :

<ol>
	<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle.">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis.">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis.">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li><li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis.">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction.">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li><li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells.">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li></ol>

مطلوبة التجربة والخطأ لإيجاد ظروف التعرض للصور عالية الجودة لكل سلالة ، نجد أن 1 ميلي ثانية واحدة غير مناسبة للصور الضوء الأبيض ، في حين أن التعرض لل100-2000 مللي المناسبة لGFP (FITC) وFM4 64 (TRITC ) الصور. وزمن التعرض تختلف تبعا لمعدات التصوير المستخدمة. نوصي باستخدام سلالة واحدة ...

وصفات محددة حل 1 : S7 10X 50 أملاح 0.5 اجتماعات الأطراف M 100 ملي سلفات الأمونيوم 50 فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ملي فلتر تعقيم ، والتفاف وسائل الاعلام في 50 S7 احباط قبل التخزين 100X المعادن 0.2 م 2 MgCl 70 ملم CaCl 2 5 ملم MnCl 2 0.1 ملم ZnCl 2 100 ميكروغرام / مل حمض الهيدروكلوريك الثيامين 2 ملم حمض الهيدروكلوريك 0.5 مم FeCl 3 * 2 O درهم للحجم النهائي * ينبغي أن يضاف 3 FeCl الماضي ، لمنع هطول الأمطار. بعد التصفية والتعقيم ، والمعادن 100X التفاف الحل في احباط. S7 50 وسائل الإعلام 1X S7 50 أملاح 1X معدنية 1 ٪ جلوكوز 0.1 ٪ جلتاميت 40 ميكروغرام / مل تريبتوفان 40 ميكروغرام / مل فينيلالاناين المقطر H 2 O للحجم النهائي 10X Spizizens (جرام / لتر) كبريتات الامونيوم 151.4 ملم (20G / L) 803.8 فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ملم (140G / L) 440.9 فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ملم (60g / L) 34.0 ملي سترات الصوديوم (10G / L) 16.6 ملي MgSO 4 (2G / L) 2 O درهم للحجم النهائي فلتر تعقيم

imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis

كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى لرد على الحمض النووي من التلف من خلال مجموعة معقدة من التغيرات الفسيولوجية. ويمكن حفز تغييرات في التعبير الجيني ، وإعادة توزيع البروتينات الموجودة ، والتجمع من البروتين مجمعات جديدة من جانب مجموعة متنوعة من آفات الحمض النووي وغير متطابقة أزواج قاعدة الحمض النووي. وقد تم استخدام المجهر مضان كأداة تجريبية قوية لتصور وقياس هذه وغيرها من الردود على آفات الحمض النووي DNA ، ورصد حالة النسخ المتماثل داخل البنية التحت خلوية معقدة للخلية الحية. وقد استخدمت متعدية اندماج بين البروتينات الفلورية مراسل ومكونات وآليات تكرار الحمض النووي لتحديد إصلاح العظة ان البروتينات التي تستهدف إصلاح الحمض النووي لهذه الآفات وما شابه ذلك<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; وعلى فهم كيف يتم تنظيم هذه البروتينات داخل الخلايا البكتيرية. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت اندماج النسخي ومتعدية مرتبطة المروجين DNA محرض الضرر الذي الخلايا ضمن مجموعة من السكان من تنشيط استجابات التوتر السامة. في هذا الاستعراض ، ونحن نقدم تفصيلية لبروتوكول باستخدام المجهر مضان لصورة التجمع للإصلاح الحمض النووي DNA والمجمعات النسخ في الخلايا البكتيرية واحد. على وجه الخصوص ، هذا العمل يركز على إصلاح البروتينات التصوير تطابق ، إعادة التركيب مثلي ، تكرار الحمض النووي والبروتينات في SOS - محرض<emالعصوية الرقيقة&gt;</em&gt;. كل الإجراءات المذكورة هنا هي قابلة بسهولة للمجمعات البروتين التصوير في مجموعة متنوعة من أنواع البكتيريا.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis at JoVE.com

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

ووصف مفصل لبروتوكول التصوير تشكيل الوقت الحقيقي من المجمعات في إصلاح الحمض النووي<emالعصوية الرقيقة&gt;</em&gt; الخلايا.

التصوير إصلاح عدم تطابق والردود الخليوي الى الحمض النووي من التلف في<emالعصوية الرقيقة></em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

10.9K Views.  University of Michigan-Ann Arbor. ووصف مفصل لبروتوكول التصوير تشكيل الوقت الحقيقي من المجمعات في إصلاح الحمض النووي الخلايا.

Video: Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA التخصيب من قبل القائم على تقنية Transposase لتحليل NGS من تسلسل كامل ل<em&gt; BRCA1</em&gt;،<em&gt; BRCA2</em&gt;، و 9 الجينات المسؤولة عن إصلاح الحمض النووي الأضرار

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة<em&gt; في فيفو</em&gt; التعرض لجرعات منخفضة جدا من بيتا وغاما والأشعة السينية

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

تحليل موائع جزيئية خلية واحدة نجحت عصية

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...