The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

وينبغي لجميع إجراءات التعامل مع والعلاج الماوس الالتزام بالقواعد التي وضعتها برامج التشريعية و / أو رعاية الحيوان والتي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المحلية. تم تنفيذ جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوان المحلية. تنبيه: كل عمل مع النشاط الإشعاعي (بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على التعامل مع التريتيوم، الخارجي γ-التشعيع، والتعامل مع الأنسجة الحيوانية المشعة والنفايات الفراش) يجب أن تلتزم القواعد المنصوص عليها من قبل السلطات التشريعية و / أو الحماية من الإشعاع وأن يقوم بها أذن الموظفين في مختبر معتمد و / أو المرفق. 1. العمل الحيوان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجمع الحيوان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا الفئران يصلون من مؤسسة خارجية، تأقلم الحيوانات لمدة 10 يوما على الأقل في منشأة الحيوان. إذا تضمنت الدراسة مجموعة العلاج متعددة، تأكد من أن المورد الحيوان يمكن أن ترسل آلالحيوانات لتر كما دفعة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عشوائيا تخصيص الفئران إلى مجموعات العلاج من 10 الفئران في المجموعة. في حالة استخدام ذكور الفئران من سلالة C57BL / 6، لدينا المورد الحيوان قبل ترتيب العشوائي من C57BL صغيرة جدا / 6 ذكور في تسهيلهم للتخفيف من قضايا العدوان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرض المزمن من الفئران إلى داخلي β-الإشعاع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تركيزات العمل من التريتيوم (10 كيلو بيكيريل / L و 1 من mbq / L) في الماوس مياه الشرب عن طريق تمييع المخزون الأصلي من HTO وOBT (خليط من البرولين معالج بالتريتيوم، ألانين والأحماض الأمينية الجلايسين) الحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من صحة تركيزات النهائي من التريتيوم في مياه الشرب من خلال قياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلألؤ السائل. ضبط تركيز، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الحيوانات لمدة شهر واحد من خلال توفير بالمال وبالشهرة أيضا وصول الإعلان إلى الماء التريتيوم. إذا وصل الماء إلى العلاج منخفضة خلال فترة أسبوعين، إضافة المزيد من الماء. خلاف ذلك، تغيير الزجاجات على أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الشام المشع السيطرةالفئران مماثل. الاحتفاظ بها في غرفة منفصلة &quot;نظيفة&quot; أو على رف منفصل &quot;نظيف&quot; تحت ضغط الهواء الإيجابي لتجنب التريتيوم انتقال التلوث من الجو. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرض المزمن من الفئران لالخارجي γ من الإشعاع ملاحظة: مرفق γ-تشعيع / المعدات تختلف تبعا للموقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الوسائل المتاحة من قياس الجرعات، وتحديد المسافات من مصدر γ للإشعاع التي تحتوي على حقول الإشعاع إنتاج معدلات الجرعة المطلوبة. ضمان تجانس مجالات الإشعاع داخل المناطق التي تغطي أقفاص الحيوانات. ملاحظة: 1.7 μGy / ساعة، أي ما يعادل نسبة الجرعة التي تنتجها 1 من mbq / L التريتيوم في الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض الفئران عن طريق وضع أقفاص الماوس على مسافات تحديدها في الخطوة 1.3.1 لمدة شهر واحد. تقليل انقطاع يومي للγ-التشعيع لمدة 30 دقيقة. استخدام مقاييس الجرعات معان بالحرارة لقياس مجموع الجرعات الممتصة. </li></ol> 2. التضحيات وأخذ العينات <oل&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأدوات الجراحية المعقمة، 60 مم أطباق بتري مع إدراج مصافى خلية 70 ميكرون، 15 مل و 1.5 مل أنابيب، ووسائل الإعلام RPMI تستكمل مع المصل 5٪ بقري جنيني (FBS) ومكان كل ما في خزانة السلامة البيولوجية. ضمان عقم العمل أمر بالغ الأهمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 5 مل من وسائل الاعلام RPMI في كل 60 مم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران باستخدام أسلوب معتمد من قبل لجنة رعاية الحيوان المحلية. خلع عنق الرحم هو خيار جيد للعمل خلية طحالية الموصوفة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة عينات الدم لفحوصات أخرى (على سبيل المثال، لmFISH، والنواة الصغرى كتلة مثبط حركة الخلايا أو غيرها من المقايسات genetoxicity شيوعا)، واستخدام ثقب داخل القلب بعد التخدير مع isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في الاستلقاء الظهري، مع رئيس لافتا بعيدا عنك. رش الماوس لأسفل مع الايثانول 70٪. باستخدام ملقط، والاستيلاء على الجلد الأمامية لفتح مجرى البول وإجراء شق صغير مع مقص في منطقة العجان. <oل&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> من هذا الشق، وقطع على طول خط الوسط بطني إلى تجويف الصدر، والحرص على قطع فقط الجلد وليس الجدار العضلي تحتها. تشريح الجلد بعيدا عن خط الوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم جدار البطن مع ملقط وقطع على طول محور وسيطة من الجدار العضلي لفتح تجويف البطن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال الطحال تجتاح بخفة مع ملقط معقم وبلطف سحب على أنه في حين خفض في وقت واحد بعيدا عن النسيج الضام مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة صغيرة من الطحال (حوالي 1/10 من الطحال) ووضعها في أنبوب 1.5 مل. المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل لتخزين اللاحق في -80 ° C لفحوصات تكميلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ما تبقى من الطحال إلى مصفاة الخلية داخل طبق بتري 60 ملم مع 5 مل من وسائل الإعلام الاستغناء قبل RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الماوس المقبل. يمكن الاحتفاظ المستخلصة والطحال في 60 ملم الأطباق مع وسائل الإعلام (لمدة تصل إلى 2 ساعة) في حين أن بقية الفئران هي التضحيه: مذكرةأد. اعتمادا على عدد من الناس المشاركة، ما بين 5 و 15 الفئران يمكن معالجتها في يوم واحد. </li></ol> 3. التحضير للثقافات خلية طحالية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الطحال تنميق داخل مصفاة الخلية مع ملقط معقم مع نهاية منحنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مصفاة الخلية وجمع تعليق خلية تصفيتها من 60 مم طبق في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مصفاة الخلية مع 5 مل من وسائل الإعلام لجمع ما تبقى من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف صب وإعادة تعليق بيليه في 10 مل من RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف صب وإعادة تعليق بيليه في 5 مل من RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 4 مل من التعليق الخلية إلى ثقافة قارورة 25 مل الأنسجة وإزالة لحاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2، الرطوبة 80٪) </li></ol> 4. تحدي الإشعاع وإصلاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقلالمتبقية 1 مل من تعليق الخلية من الخطوة 3.8 في أنبوب 1.5 مل على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. والحمض النووي من التلف تقاس في هذه العينة تمثل كل من الأضرار التي يسببها العلاج ور = 0 بيانات نقطة لبناء منحنى إصلاح الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS العازلة (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر من TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الاختلاط في دوامة في سرعة منخفضة، إضافة 700 ميكرولتر من -20 ° C الإيثانول بنسبة 100٪. إغلاق الغطاء وعكس عدة مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين العينات في -20 ° C. Splenocytes ثابتة في الإيثانول يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 12 شهرا على الأقل بدون أي خسارة ملحوظة في إشارة γH2AX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق الثقافات خلية طحالية من الخطوة 3.8 مع تحديا γ-راد<html> جرعة ينتقم من 2 غراي في ≥ معدل الجرعة 200 mGy / دقيقة باستخدام جهاز تشعيع المتاحة. ملاحظة: إن الغرض من هذا الإشعاع هو للحث على الحمض النووي DSB للطعن في آلية إصلاح. ويمكن أيضا الأشعة السينية يمكن استخدامها لهذا الغرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة فورا الثقافات إلى CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ساعة بعد التحدي 2 غراي التشعيع، وإزالة الثقافات من الحاضنة لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. لجمع عينة تمثيلية قسامة، بلطف اعادة تعليق الخلايا باستخدام pipettor ونقل 1 مل من تعليق خلية إلى أنبوب 1.5 مل على الجليد. العودة الثقافات الخلية إلى CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،3-4،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد التحدي 2 غراي γ-التشعيع، والحصاد وإصلاح في = 24 ساعة العينة كما هو موضح في الخطوة 4،8-4،10. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. مناعي وصفها مع لمكافحة γH2AX جسم ملاحظة: عادة، 15-30 عينات يوميا يمكن أن توصف immunofluorescently ويعاير بواسطة التدفق الخلوي في شوط واحد. لضمان إجراء مقارنة دقيقة بين مجموعات العلاج، وتشمل العينة (ق) من كل مجموعة. انظر أيضا مرجع 16 لمزيد من التفاصيل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجموعة المسمى أنابيب لعدد من العينات التي سيتم تجهيزها ومكان على الجليد. استخدام 12 × 75 ملم أنابيب زجاجية لم يسبق لهم اللعب. غير مطلوب العقم لهذا العمل. وتشمل العينة الضابطة واحدة إضافية تاريخية لوضع العلامات مع الأجسام المضادة الثانوية فقط (&quot;2 أب فقط&quot;). استخدام هذه العينة السيطرة التاريخية في كل التدفق الخلوي تشغيل ضمن دراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من TBS الجليد الباردة إلى كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة splenocytes الثابتة من -20 ° C، دوامة لمدة 5 ثوانى ونقل 0.5 مل قسامة إلى أنابيب مستعدة مع TBS. وضع ما تبقى من عينات مرة أخرى إلى -20 ° C تخزين والحفاظ على عينة احتياطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> splenocytes أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من الجليد الباردة TBS تحتوي على 1٪ FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من تجارة الرقيق عبر الأطلسي العازلة (0.05٪ تريتون X-100، 2٪ FBS في TBS). احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من الابتدائي مكافحة γH2AX الأجسام المضادة المخفف 1: 150 العازلة في تجارة الرقيق عبر الأطلسي. استخدام 200 ميكرولتر من تجارة الرقيق عبر الأطلسي ل&quot;2 أب فقط&quot; العينة الضابطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب موقف على شاكر الدورية في زاوية من 45 - 60 درجة ويهز لمدة 1.5 ساعة عند 300 x ج في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أنابيب تحتضن، وإعداد حجم كاف (200 ميكرولتر / عينة) من الماعز لمكافحة فأر الضد الثانوية مترافق مع اليكسا-488 في 1: 200 التخفيف العازلة في تجارة الرقيق عبر الأطلسي. ملاحظة: كل عمل يستدعي اليكسا-488وينبغي أن يتم الضد مترافق (الخطوات 5،10-5،16 أدناه) في ظل ظروف الإضاءة الخافتة ويجب حماية العينات وصفت من الضوء من خلال التفاف الأنابيب في رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد الانتهاء من 1.5 ساعة الحضانة، إضافة 1 مل من TBS الجليد الباردة التي تحتوي على 2٪ FBS إلى كل أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS تحتوي على 2٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية من الخطوة 5.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات على منصة تهتز لمدة 1 ساعة كما في الخطوة 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من TBS الجليد الباردة التي تحتوي على 1٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 0.5 مل من TBS تحتوي على 50 ميكروغرام / مليوديد propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 5 دقائق على RT محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات على تدفق عداد الكريات باستخدام بروتوكولات أداة محددة 16. قراءة لا يقل عن 10،000 الخلايا لكل عينة. </li></ol>

<ol>
	<li>Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptive+response+modifies+latency+for+radiation-induced+myeloid+leukemia+in+CBA/H+mice.">The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice.</a> Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).</li><li>Shadley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+adaptive+response+in+human+lymphocytes.">Chromosomal adaptive response in human lymphocytes.</a> Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).</li><li>Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+[3H]thymidine-induced+adaptive+response+of+human+lymphocytes+to+subsequent+doses+of+X-rays+involves+the+induction+of+a+chromosomal+repair+mechanism).">Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism).</a> Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).</li><li>Mitchel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dose+window+for+radiation-induced+protective+adaptive+responses.">The dose window for radiation-induced protective adaptive responses.</a> Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).</li><li>Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+no-threshold+relationship+is+inconsistent+with+radiation+biologic+and+experimental+data.">The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data.</a> Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).</li><li>Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+stability+and+the+DNA+double-stranded+break+connection.">Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection.</a> Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).</li><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+repairing+DNA+double-strand+breaks.">Sensing and repairing DNA double-strand breaks.</a> Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+(125)IdU-induced+DNA+double-strand+breaks+with+gamma-H2AX+antibody.">Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody.</a> Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).</li><li>Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus+on+histone+variant+H2AX:+to+be+or+not+to+be.">Focus on histone variant H2AX: to be or not to be.</a> FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).</li><li>Taneja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2AX+phosphorylation+as+a+predictor+of+radiosensitivity+and+target+for+radiotherapy.">Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy.</a> J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+histone+H2AX+in+spheroids,+tumors,+and+tissues+of+mice+exposed+to+etoposide+and+3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.">Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.</a> Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+double-strand+breaks+is+not+modulated+by+low-dose+gamma+radiation+in+C57BL/6J+mice.">Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice.</a> Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).</li><li>Runge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+interpretation+of+ionizing+radiation-induced+gammaH2AX+foci+by+the+novel+pattern+recognition+system+AKLIDES(R).">Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R).</a> Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).</li><li>Jucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FociCounter:+A+freely+available+PC+programme+for+quantitative+and+qualitative+analysis+of+gamma-H2AX+foci.">FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci.</a> Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).</li><li>Garty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RABIT:+a+rapid+automated+biodosimetry+tool+for+radiological+triage.">The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage.</a> Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).</li><li>Kovalchuk, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+DNA+repair+in+radiation-exposed+mice.">Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice.</a> Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).</li><li>Rube, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+in+the+context+of+chromatin:+new+molecular+insights+by+the+nanoscale+detection+of+DNA+repair+complexes+using+transmission+electron+microscopy.">DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy.</a> DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).</li><li>Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+stress+genes+by+low+doses+of+gamma+rays.">Induction of stress genes by low doses of gamma rays.</a> Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).</li></ol>

The authors declare that there are no known competing financial interests.

بروتوكول الواردة في هذه الورقة هو مفيد لإجراء الماوس على نطاق واسع في الدراسات المجراة دراسة الآثار السامة للجينات من مستويات منخفضة من مختلف العوامل الكيميائية والفيزيائية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة. منشأتنا الحيوانات خالية من مسببات الأمراض محدد فر?...

جدل كبير بشأن الآثار الضارة المحتملة من تناول جرعات منخفضة أو منخفضة جدا من الإشعاع والخوف الجمهور من الإشعاع، مدفوعا صورا للتفجيرات الذرية هيروشيما وناغازاكي والنادرة الحوادث محطة نووية المؤينة (التي تفاقمت بسبب وسائل الإعلام)، قد أدى إلى غاية تنظيم الحماية من الإشعاع الصارم والمعايير التي يمكن أن تكون غير مبررة علميا. في العقود الثلاثة الماضية، وقد وثقت تقارير عديدة سواء لعدم وجود ضارة وجود الآثار البيولوجية يمكن أن تكون مفيدة الناجمة عن الإشعاع جرعة منخفضة 1-4. عوامل الخطر الصحية للإشعاع الرئيسي هو احتمال السرطان، تقديرها بناء على دراسات وبائية من الناجين من القنبلة الذرية تلقي جرعات عالية أو متوسطة من الإشعاع. يستخدم الخطية استقراء هذه البيانات (ما يسمى خطية أي عتبة أو نموذج LNT) لتقدير مخاطر الإصابة بسرطان بجرعات منخفضة. ومع ذلك، لم تتلق هذا النهج القبول العلمي على مستوى العالموناقش بشكل كبير 5. ومن الواضح أن هناك حاجة لمزيد من الدراسات لتوضيح هذه المسألة، وربما تحسين مستويات الحماية من الإشعاع. وينبغي أن تشمل هذه الدراسات العلاجات المزمنة (أفضل تقريب التعرض للعوامل البيئية والمهنية)، في النماذج الحيوانية الجسم الحي (أفضل لاستقراء آثار للإنسان) وهذه النقاط النهائية عن معدلات الحمض النووي من التلف، وإصلاح الحمض النووي والطفرات. ومن المعروف أن الحمض النووي هو الهدف الرئيسي لإتلاف آثار الإشعاع وغير مكتملة أو سوء إصلاح قد يؤدي إلى الطفرات والسرطان تطوير 6. DNA الكسر مزدوج الحبل (DSB) هي واحدة من أكثر أنواع ضارة من آفات الحمض النووي وربما تؤدي إلى موت الخلايا وتكون الأورام 7. ولذلك، من المهم أن تكون قادرة على موثوق ودقيق قياس مستوى DSB بعد التعرض لجرعة منخفضة من الإشعاع و / أو غيرها من الإجهاد، مثل الملوثات الكيميائية. واحدة من علامات الأكثر حساسية ومحددةمن الحمض النووي DSB غير فسفرته هيستون H2AX، ودعا γH2AX 8، ولكن قد اقترحت علامات وغيرها من الأساليب 9،10. وتشير التقديرات إلى أن الآلاف من جزيئات H2AX، في المنطقة المجاورة لجهاز تسوية المنازعات التي يسببها، ويشارك في تشكيل γH2AX تمكين الكشف عن الفردية DSB التي وصفها مناعي مع مضاد للγH2AX الأجسام المضادة ومضان المجهر 11. كانت الاستجابة سريعة جدا، حيث بلغ حده الأقصى بين 30 و 60 دقيقة. يوجد دليل على أن γH2AX يسهل إصلاح الحمض النووي DSB من خلال جذب عوامل تصليح أخرى إلى مواقع فواصل، وتعديل هيكل لونين لترسيخ نهايات الحمض النووي مكسورة وتوفير إمكانية الوصول للبروتينات تصليح أخرى (إعادة النظر في 12). عند الانتهاء من إصلاح الحمض النووي DSB، ويحصل على γH2AX إلغاء فسفرته و / أو يخضع لتدهور، والجزيئات H2AX مركبة جديدة تحل محل γH2AX في المناطق المتضررة من لونين 10. رصد تشكيل وفقدان γH2AX يمكن،لذلك، تقديم تقدير دقيق للDNA DSB حركية الإصلاح. وقد استخدم هذا النهج لدراسة إصلاح جهاز تسوية المنازعات في مختلف خطوط الخلايا السرطانية البشرية المشع مع جرعات عالية من الإشعاع ومعدل ومستويات DSB المتبقية وقد ثبت للربط مع حساسية للأشعة 13-15. نحن تعديل هذا المنهج التجريبي وتطبيقه على دراسة الماوس في الجسم الحي لدراسة آثار الجرعات المنخفضة من γ- المزمنة وβ-التشعيع على مستويات الحمض النووي DSB و إصلاحها (الشكل 1). أولا، علينا أن نظهر وسيلة لإجراء التعرض على المدى الطويل المزمن من الفئران إلى β-الإشعاعات المنبعثة إما عن طريق التريتيوم (هيدروجين 3) في شكل الماء معالج بالتريتيوم (HTO) أو التريتيوم ملزمة عضويا (OBT) الذائب في مياه الشرب . ومن المتوقع أن تتراكم و / أو توزيع مختلف في الجسم، وبالتالي، تنتج تأثيرات بيولوجية مختلفة الأشكال اثنين. كلا الشكلين هي الأخطار المحتملة في الصناعة النووية. هذا العلاجيقابل من جانب التعرض المزمن للγ للإشعاع بمعدل جرعة مكافئة للسماح مقارنة الصحيحة من أنواع الإشعاع اثنين، وهو أمر حاسم لتقييم فعالية البيولوجية النسبية. يتكون بيتا للإشعاع من إلكترونات، مما يجعلها تختلف كثيرا عن γ للإشعاع، الفوتونات ذات الطاقة العالية. ونتيجة لهذا الاختلاف، Β للإشعاع يمثل خطرا على الصحة في الغالب الداخلي وربما يكون لها آثار بيولوجية مختلفة مقارنة γ للإشعاع. وأسفرت هذه المضاعفات في خلافات كبيرة على تنظيم التعرض لβ-الاشعاع المنبعث من HTO. وهكذا، ومستويات تنظيمية من HTO في المياه الصالحة للشرب للجمهور تختلف من 100 بيكريل / L في أوروبا إلى 75000 بيكريل / L في أستراليا. ولذلك، من المهم للمقارنة التأثيرات البيولوجية للHTO لجرعات يعادل γ للإشعاع. ثانيا، يتم قياس معدل الحمض النووي DSB في splenocytes معزولة عند الانتهاء من التعرض المزمن باستخدام المسمى immunofluorescently γH2AX كشفإد التدفق الخلوي. وهذا يسمح للتقييم مدى التلف في الحمض النووي من قبل في الجسم الحي التعرض الواقع. ومع ذلك، فمن المنطقي أن نتوقع أن مثل هذه التعرضات مستوى منخفض قد لا ينتج أي نسب ملحوظة من الحمض النووي DSB. بدلا من ذلك، بعض التغييرات الخفية / قد يكون من المتوقع من شأنها أن تؤثر على قدرة الخلايا على إصلاح الحمض النووي من التلف الردود. هذه التغيرات، إذا وجدت، قد تكون إما المحفزة (تنتج تأثير مفيد) أو المثبطة (إحداث تأثير ضار). البروتوكول المقترح يسمح تكشف هذه التغيرات من خلال تحدي splenocytes المستخرجة مع جرعة عالية من الإشعاع التي تنتج قدرا كبيرا من الضرر (على سبيل المثال، 2 غراي إنتاج ما يقرب من 50 DNA جهاز تسوية المنازعات في خلية أو 3 - زيادة بنسبة 5 أضعاف في المستوى الإجمالي γH2AX) . وفي وقت لاحق، وتشكيل وفقدان γH2AX، مما يعكس بدء والانتهاء من إصلاح جهاز تسوية المنازعات، ويتم رصد التدفق الخلوي. بهذه الطريقة، ليس فقط القاعدية والمستويات التي يسببها العلاج من الحمض النووي DSB يمكن قياسها، ولكنأيضا تأثيره المحتمل على قدرة الخلايا على الاستجابة وإصلاح الحمض النووي من التلف الناجم عن مستويات الإجهاد أعلى من ذلك بكثير.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

انخفاض جرعة التعرض للإشعاع قد تنتج مجموعة متنوعة من الآثار البيولوجية التي تختلف في كمية ونوعية من الآثار التي تنتجها جرعات عالية من الإشعاع. معالجة المسائل المتعلقة بالسلامة والصحة البيئية والمهنية والعامة بطريقة سليمة ومبررة علميا يعتمد بشكل كبير على القدرة على قياس دقيق لآثار البيولوجية للملوثات جرعة منخفضة، مثل المؤينة المواد الإشعاعية والكيميائية. الضرر وإصلاح الحمض النووي هي مؤشرات مبكرة أهم المخاطر الصحية بسبب العواقب على المدى الطويل المحتملة، مثل السرطان. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة تأثير التعرض المزمن في الجسم الحي لجرعات منخفضة من γ- وβ-الإشعاع على الحمض النووي من التلف وإصلاح في خلايا الطحال الماوس. باستخدام علامة مقبولة عموما من الحمض النووي الكسر مزدوج الحبل، مفسفر H2AX هيستون دعا γH2AX، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدامها لتقييم ليس فقط على مستوى الحمض النووي من التلف، ولكن التغييرات أيضافي قدرة إصلاح الحمض النووي المنتجة يحتمل بجرعة منخفضة في التعرض الجسم الحي. التدفق الخلوي يسمح قياس سريعة ودقيقة وموثوق بها من المسمى immunofluorescently γH2AX في عدد كبير من العينات. يمكن تقييم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر من خلال تعريض splenocytes استخراج إلى جرعة الصعبة من 2 غراي لإنتاج عدد كاف من DNA فواصل لتحريك إصلاح وعن طريق قياس يسببها (1 ساعة بعد التشعيع) والحمض النووي من التلف المتبقية (24 ساعة بعد التشعيع). أن الحمض النووي من التلف المتبقي يكون مؤشرا على إصلاح ناقصة وخطر عدم الاستقرار الجيني على المدى الطويل والسرطان. جنبا إلى جنب مع فحوصات أخرى ونقطة النهاية التي يمكن بسهولة أن يقاس في مثل هذه الدراسات المجراة (على سبيل المثال، التشوهات الكروموسومية، ترددات النويات في الشبكيات نخاع العظام، والتعبير الجيني، وما إلى ذلك)، وهذا النهج يتيح إجراء تقييم دقيق والسياقية للآثار البيولوجية من الضغوطات مستوى منخفض.

ويبين الشكل 2 أمثلة من التدفق الخلوي الرسوم البيانية المتوقعة لsplenocytes أعدت باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. هي بوابات الخلايا أولا على أساس &lt;الإلكترونية مبعثر الجانب حجم&gt; مؤامرة مبعثر (الشكل 2A و 2D، حجم الإلكترونية ما يعادل مبعثر إلى الأما...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation at JoVE.com

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة<em&gt; في فيفو</em&gt; التعرض لجرعات منخفضة جدا من بيتا وغاما والأشعة السينية

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K Views.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

Video: Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

التصوير إصلاح عدم تطابق والردود الخليوي الى الحمض النووي من التلف في<emالعصوية الرقيقة></em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

MG53 تصور بوساطة غشاء الخلية عن طريق إصلاح في الجسم الحي و في المختبر أنظمة

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA التخصيب من قبل القائم على تقنية Transposase لتحليل NGS من تسلسل كامل ل<em&gt; BRCA1</em&gt;،<em&gt; BRCA2</em&gt;، و 9 الجينات المسؤولة عن إصلاح الحمض النووي الأضرار

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

وهناك طريقة استنساخه للغاية ومباشرة إلى تنفيذ<em&gt; في فيفو</em&gt; قلع العين في الفأر بعد فتح العين

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.