نود أن نشكر الأشخاص الذين التالي دون مساعدة مجموعة من الأنسجة الصنوبر لن يكون ممكنا : الدكتور جو نيرن ، Bryman مات ، مايكل بوردو ، Bagal Ujwal ، جين Huizhe ، وأماندا بوفييه.

الجزء 1 : حصاد شجرة بعد اختيار الأشجار وقطعها ، فإنه من المهم أن تعمل بدقة وبأسرع وقت ممكن. كما هو حصاد كل نوع من أنواع الأنسجة المختلفة ، ينبغي وضعها على الفور في السفن الخاصة النيتروجين السائل لتفادي أي تلوث المواد عبر العينة. هذا البروتوكول هو عزل الحمض النووي الريبي للتحجيم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع البراغي في أطوال حوالي متر و0،5-،75 برصيد بالمنشار النباح في اثنين أو ثلاثة من الأماكن التالية المحور الطولي للالترباس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إزميل الخشب ، والعمل على حافة المنطقة وسجل حتى النباح يبدأ فصل من الخشب ومواصلة العمل في حين تتراجع إزميل على قسم من النباح حتى أنه يفصل تماما من الجذع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخشب الثانوي بشفرة الحلاقة حافة مستقيمة ، وقفت وحيدة عن طريق كشط على طول المحور الطولي للالترباس الذي تم تجريده من النباح. ارتداء قفازات مطاطية للحد من التلوث من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد بسهولة اللحاء ، والذي يقع على الجانب الداخلي للأبواب النباح ، وذلك دليل تقشير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم جمع الخشب رد فعل من الجانب السفلي من أطرافه بعد وضع العلامات عليها بطلاء للإشارة إلى ميولهم الأصلي مع احترام الأرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع أطرافه في المسامير من 1-2 م وسجل على طرفي نقيض على طول المحور الطولي وفقا لمواقع التقريبية لهذين النوعين من الخشب رد فعل : الخشب المعاكس (على الجانب العلوي من أطرافه) والخشب الضغط (على القاع جانب الأطراف). يتم فصل النباح من الطرف على النحو المبين أعلاه ، إلا أنه الوحيد هو إزالة اللحاء التي تغطي كل نوع من أنواع الخشب رد فعل في وقت واحد. ثم يتم جمع الخشب أو اللحاء الثانوي على النحو الموصوف أعلاه ، وضعت في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن حصاده عينات أخرى ، مثل الإبر ، نصائح اطلاق النار والمخاريط الشباب ، وباليد أو باستخدام المقصات التقليم على النحو المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن توضع العينات التي تم جمعها مجمدة في النيتروجين السائل في أكياس أو حاويات مناسبة ملحوظ ومعبأة في الجليد الجاف ليعود شحنها إلى المختبرات. </li></ol> الجزء 2 : تصنيع برادات مطحنة للعينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاحونة ملء خزان سبكس الفريزر 6850 مع النيتروجين السائل ووضع شريط أثر في واحدة من طحن وتعبئة قوارير مع النيتروجين السائل لتبريد المسبق. تخلصي النيتروجين السائل وإضافة إلى عينة القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن أي فائض النتروجين السائل يبقى في غرفة الطحن وتنفيس تماما أن غاز النيتروجين الزائد قبل الجلوس على سقف نهاية لاغلاق الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج القارورة طحن في الناقل وثيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الخشبية مصنع لدورتين من 1 دقيقة / دورة في الإعداد بنسبة 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة النيتروجين السائل المبرد لإزالة عينة المضروب (دقيق الخشب) في الدورق الذي تم قبل المبردة ويحتوي على كمية صغيرة من النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب النيتروجين السائل / عينة الطين في وعاء التخزين ومكان عقد الاجتماع -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. </li></ol> الجزء 3 : عزل الحمض النووي الريبي ، يوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20mL من الاحتياطي عزل الحمض النووي الريبي في أنبوب 50mL فالكون توج مكان وإضافة 400 ميكرولتر β - المركابتويثانول ، الدوامة لفترة وجيزة ، ثم الحرارة في الحمام 60 ° C المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 غرام من الأنسجة المجمدة على كل أنبوب. قبعة ويهز بقوة باليد تليها vortexing لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من الكلوروفورم في أنبوب وعكس برفق لالمزيج. وضع أنبوب على عجلة دوارة ، والسماح نهاية الإفراط في نهاية الخلط لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الخليط في أنبوب 50 مل أوك ريدج والطرد المركزي في 12000 (17200 XG) دورة في الدقيقة في الدوار الزاوية الثابتة SS34 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى المرحلة المائية أنبوب أوك ريدج جديدة وإضافة نصف حجم الكلوروفورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لمدة 1 دقيقة ، ويستمر الخلط على عجلة دوارة لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (17200 XG) في الدوار SS34 زاوية ثابتة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى المرحلة المائية العذبة أنبوب أوك ريدج وإضافة نصف حجم الكلوروفورم. دوامة لمدة 1 دقيقة. الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (17200 XG) في الدوار SS34 زاوية ثابتة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة المائية إلى 50 مل أنبوب البولي بروبلين عالية السرعة. الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة (11900 XG) في الدوار SS34 زاوية ثابتة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف في أنبوب 50 مل فالكون وإضافة ربع حجم 10 M إلى حل LiCl طاف. دوامة لفترة وجيزة ووضع على 4 درجات مئوية لهطول الأمطار خلال الليل. </li></ol> الجزء 4 : عزل الحمض النووي الريبي ، يوم 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة للحرارة في حمام SSTE 65 ° C المياه قبل البدء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب العينة LiCl - عجلت في أنبوب بولي بروبلين وبيليه في الحمض النووي الريبي بواسطة الطرد المركزي في 11000 دورة في الدقيقة في الدوار SS34 زاوية ثابتة (14450 XG) لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ،من أجل الخروج وتجاهل السائل ، وعكس الأنابيب على Kimwipes لحوالي 1 دقيقة. ماصة إيقاف أي طاف المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend كل بيليه في 800 ميليلتر من SSTE يسخن باستخدام ماصة إلى مزيج دقيق من العينات. نقل العينة إلى 2 مل معلق أنابيب Ambion microfuge ريبونوكلياز خالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها vortexing حثيثة لضمان إعادة تعليق كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من الفينول كلوروفورم ، pH8 ، إلى كل أنبوب العينة. دوامة كل عينة لمدة 30 ثانية ثم تدور في microfuge 14000 دورة في الدقيقة في مدة 3 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى المرحلة المائية Ambion 2mL أنابيب جديدة microfuge ريبونوكلياز خالية ، وإضافة حجم مساو من الكلوروفورم. دوامة كل عينة لمدة 30 ثانية ، وتدور في microfuge 14000 دورة في الدقيقة في مدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى المرحلة المائية أنابيب جل قفل المرحلة التي تم إعدادها سابقا من قبل microfuging في 11000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. إضافة نصف حجم الكلوروفورم وماصة برفق لالمزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 11000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ونقلها إلى مرحلة جديدة مائي 2mL أنابيب Ambion microfuge ريبونوكلياز خالية. </li></ol> الجزء 5 : رنا الأمطار واغسل الايثانول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر الصوديوم 3.0 M أسيتات ، ودرجة الحموضة 4.8 و 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ في المرحلة مائي. ويعجل في دوامة -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في عينات Microfuge 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية ، ونضح بعناية قبالة طاف. لا تخل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الكريات RNA مع 1 مل من الايثانول درجة مئوية 70 ٪ (V / V) -20. Microfuge في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة ، ونضح قبالة الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفع قبعة الأنابيب وكريات الهواء الجاف على مقاعد البدلاء لمدة 3-5 دقائق. </li></ol> الجزء 6 : إعادة تعليق النهائي والكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend كل بيليه في 100 DEPC المياه المعالجة ميكرولتر. مزيج من قبل vortexing واحتضان الأنابيب في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة قبل ان يضع على الجليد. كرر إذا لزم الأمر لضمان إعادة تعليق العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع عينات مثل الرغبة وجعل 50 ميكرولتر من التخفيف في تريس 01:10 10MM ، ودرجة الحموضة 7.5 ، عن الكميات الطيفي. نسب الامتصاصية ل260/280 260/230 وعادة ما تكون أكبر من 2.1 و 2.2 على التوالي. RNA مجموعة غلة بمعزل عن 120μg - 60 / ز الأنسجة المجمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينات من الحمض النووي الريبي ميكروغرام عن طريق تشغيل 1،5-2،5 على agarose هلام 1 ٪ في المخزن تاي. لعينات أكثر حرجا ، وتحليل الحمض النووي الريبي باستخدام 2100 اجيلنت Bioanalyzer حسب تعليمات الشركة المصنعة. </li></ol> ممثل النتائج : غلة العزلة RNA من مختلف أنسجة الصنوبرية نطاق 60-120 ميكروغرام / ز الأنسجة المجمدة مع عينات الخشبية العائد عادة حوالي 80G - 70 / ز الأنسجة المجمدة. نسب تشخيص 260/280 260/230 وكلاهما أكبر من 2.1 عادة ، ومؤشرات جيدة على أن عينة الحمض النووي الريبي وخالية من أي تلوث أو الفينولية كبيرة من الكربوهيدرات ، على التوالي. وينبغي أن العينات التي تم تحليلها من قبل الكهربائي للهلام agarose تليها تلطيخ EtBr تظهر ثلاثة نطاقات متميزة لل25S ، 18S ، و5S RNA (الشكل 1). تحديد رياضيات الكيمياء لل28S 18S إلى المواد الهلامية على agarose غير موضوعي إلى حد ما ، والعوامل مثل تشغيل الظروف لهلام ، تلوين ، وتحميل كل نموذج يمكن أن يكون لها تأثير. بوجه عام ، 28S : سوف 18S يبدو أن نسبة&gt; 1.5. ومع ذلك ، بعض العينات الصنوبرية وأقل النسب. على سبيل المثال ، وبعد تحليل اجيلنت 2100 شهدنا حالات عديدة لعينات من أنواع الأنسجة الصنوبرية مختلفة حيث رياضيات الكيمياء هو اقرب الى 1.2:1. وبالتالي ، وهو ما يبدو 28S منخفض : رياضيات الكيمياء 18S التي agarose هلام إستشراد لا يدل بالضرورة على عينة ذات نوعية رديئة. أوراق ، واطلاق النار ، وعينات مخروط سوف يكون في كثير من الأحيان نطاقات مميزة إضافية الراهن ، نظرا إلى الرنا الريباسي البلاستيدات الخضراء. EtBr الملطخة المواد التي لا تهاجر من العينة جيدا أو نطاقات عالية الكتلة الجزيئية (&gt; 80-10 كيلوبايت) تشير عادة التلوث الجيني DNA (الشكل 2). انخفاض مسحات الكتلة الجزيئية في محيط أو أقل من الفرقة وخفضت 5S تلطيخ الفرقة أو الريباسي 18S واضح&gt; 28S رياضيات الكيمياء يعد مؤشرا جيدا أن الحمض النووي الريبي تدهور حدث (الشكل 3). في تحليل مخطط رحلاني اجيلنت 2100 ، خط الأساس ينبغي أن تكون منخفضة نسبيا وسلس مع القمم الرئيسية المقابلة ل18S 28S الرنا الريباسي وجود 28S : 18S نسب تتراوح في أي مكان 1،2-2،0. قد النزاهة RNA اجيلنت رقم (رين) قيمة يكون أفضل مؤشر لنوعية الحمض النووي الريبي ، وينبغي أن لا يقل عن 7 أو أكبر للالحمض النووي الريبي التي يتم استخدامها لإعداد الأهداف ميكروأري. ويبين الشكل 4 نموذجي اجيلنت 2100 عن مخطط رحلاني RNA الخشب مع 28S : 18S نسبة مساوية لقيمة 1.4 و 8.6 RIN بينما يظهر الشكل رقم 5 الزيليم الفقراء RNA الإعدادية وجود خط رفيع للغاية ، وتدهور ملحوظ كما كشفت عنها 28S : 18S RAيساوي 0.65 وقيمة قدرها 3.4 RIN تيو. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> هلام Agarose الرقم 1. تحليل الحمض النووي الريبي الصنوبر العالية الجودة. حارة 1 ، 1 ك NEB القياسية ، 2 لين معارض نموذجية العزلة من الحمض النووي الريبي مجموع الخشب الصنوبر loblolly الثانوية مع 28S الريباسي مميزة ، 18S ، وشرائح 5S 28S واضحا : 18S النسبة&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> هلام Agarose الرقم 2. تحليل عينة الحمض النووي الريبي DNA الصنوبر ملوثة الجيني. حارة 1 ، 1 ك NEB القياسية ، 2 لين ، الزيليم عينة الحمض النووي الريبي DNA تبين التلوث الجيني. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> هلام Agarose الرقم 3. تحليل عينة من الحمض النووي الريبي الصنوبر تبين التدهور والتلوث مع الحمض النووي الجيني. حارة 1 ، 1 ك NEB القياسية ، Lane2 ، الزيليم عينة الحمض النووي الريبي DNA تبين التلوث الجيني وتدهور شديد الحمض النووي الريبي. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4 المعزولة. اجيلنت 2100 مخطط رحلاني من الحمض النووي الريبي مجموع الخشب باستخدام طريقة وصفها على الخشب الصنوبر loblolly. 28S : 18S يساوي نسبة 1.4 ، RIN تعادل قيمتها 8،6 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. اجيلنت 2100 مخطط رحلاني غيض من الحمض النووي الريبي مجموع قمية يظهر التدهور الشديد والتلوث الجيني. 28S : 18S يساوي نسبة 0.65 في رين تعادل قيمتها 3،4

<ol>
	<li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees.">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Sim&#369;es, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray.">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li></ol>

يمكن الحصول على نوعية عالية من الحمض النووي الريبي الأنواع الصنوبرية يكون مهمة صعبة نظرا لمستويات عالية من مركبات الفينول والسكاريد موجودة في الأنسجة الخشبية. بدءا من البروتوكول التي وضعتها تشانغ وآخرون. (1) ، وجدنا أن استخراج أكثر صرامة وتنظيف خطوات تؤدي إلى العزلة ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA Isolation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>C298-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15509-037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10M LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>SSTE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol-chloroform (pH8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Oak Ridge High Speed Teflon Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-16B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene 50mL High Speed Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-10K</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>#21008-939</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#2302830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion, Inc.</td>
<td>#AM12425</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species

الأنسجة المعزولة من الأنواع الصنوبرية ، وبخاصة أولئك الذين ينتمون إلى عائلة Pinaceae ، مثل الصنوبر loblolly (<em&gt; صنوبر taeda</em&gt; L.) ، تحتوي على تركيزات عالية من مركبات الفينول والسكريات التي تتداخل مع تنقية الحمض النووي الريبي. العزلة ذات جودة عالية من الحمض النووي الريبي هذه الأنواع تتطلب إجراءات صارمة لجمع الأنسجة في هذا المجال والعمل على وضع بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي يتألف من عدة خطوات استخراج العضوية من أجل عزل الحمض النووي الريبي ذات نوعية كافية لميكروأري الجينومية والتحليلات الأخرى. عزل ذات جودة عالية من الحمض النووي الريبي الميداني بجمع عينات من الصنوبر loblolly صعبة يمكن ان يكون ، ولكن تعديلات عدة على مستوى الأنسجة وإجراءات عزل الحمض النووي الريبي تحسن كثيرا من النتائج. مدى تدهور RNA زيادات عامة إذا لم يتم بشكل صحيح العينات التي تم جمعها ونقلها من الميدان ، ولا سيما خلال مواسم الحصاد على نطاق واسع. ويمكن زيادة غلة مجموع عينات الحمض النووي الريبي بشكل ملحوظ في تحطيم مصنع النيتروجين السائل المجمد قبل RNA العزلة ، وخصوصا عندما تأتي من عينات الأنسجة الخشبية. هذا يرجع أساسا إلى وجود عوامل المؤكسدة ، مثل مركبات الفينول ، والسكريات التي هي على حد سواء الحالية على مستويات عالية في مقتطفات من الأنسجة الخشبية لمعظم الأنواع الصنوبرية. إن لم يكن إزالة ، ويمكن لهذه الملوثات تحمل أكثر مما يؤدي إلى مشاكل ، مثل تدهور RNA ، التي تؤدي إلى انخفاض غلة والفقراء عينة الحمض النووي الريبي الجودة. يمكن المرحل من المركبات الفينولية ، فضلا عن السكريات ، وخفض أيضا أو حتى القضاء تماما على نشاط أو الناسخ العكسي polymerases الأخرى المستخدمة عادة لتخليق [كدنا]. ويجب على وجه الخصوص ، RNA الموجهة لاستخدامه كقالب لالمزدوج تقطعت بهم السبل التوليف [كدنا] في توليد مكتبات [كدنا] ، واحد الذين تقطعت بهم السبل التوليف [كدنا] لPCR أو في qPCR ، أو لتجميع المواد المستهدفة ميكروأري تكون من أعلى مستوى من الجودة إذا ما توصل الباحثون يتوقعون للحصول على النتائج المثلى. تقنيات عزل الحمض النووي الريبي استخداما بالنسبة للعديد من الأنواع النباتية الأخرى وغالبا ما تكون غير كافية من حيث قدرتها على إزالة هذه الملوثات من عينات الصنوبرية ، وبالتالي لم تسفر مجموع عينات الحمض النووي الريبي مناسبة للتلاعب المصب. في هذا الفيديو نظهر أساليب الجمع الميداني للأنسجة الصنوبرية ، بدءا من قطع شجرة عمرها الأربعين ، إلى حصاد اللحاء ، الخشب الثانوي ، وتفاعل الخشب الخشب. نظهر ايضا بروتوكولا العزلة الحمض النووي الريبي التي أسفرت باستمرار عالية الجودة الحمض النووي الريبي للتلاعب الأنزيمية لاحقة.

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species at JoVE.com

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

العديد من الأنسجة النباتية ، بما في ذلك اللحاء والخشب من الصنوبر loblolly (<em&gt; صنوبر taeda</em&gt; L.) ، تحتوي على مستويات عالية من السكريات والفينولات التي تتداخل مع تنقية الحمض النووي الريبي. يناقش هذا العرض التقديمي تقنيات حصاد الميداني نمت الأنسجة وعزل الحمض النووي الريبي ذات نوعية كافية لميكروأرس الجينومية والتحليلات الأخرى.

طريقة محسنة لعزل الحمض النووي الريبي من الصنوبر Loblolly ( P. taeda L.) والأنواع الأخرى الصنوبرية

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

13.7K Views.  University of Georgia (UGA). العديد من الأنسجة النباتية ، بما في ذلك اللحاء والخشب من الصنوبر loblolly ( صنوبر taeda L.) ، تحتوي على مستويات عالية من السكريات والفينولات التي تتداخل مع تنقية الحمض النووي الريبي. يناقش هذا العرض التقديمي تقنيات حصاد الميداني نمت الأنسجة وعزل الحمض النووي ال?...

Video: An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

معالجة Loblolly باين PtGen2 ميكروأري [كدنا]

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

مصاصة للدماء العزل من السائل خارج الخلية من<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

لتحسين طريقة لقياس دقة وسرعة الأداء في الطيران<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

الهجين قطع: طريقة محسنة باجتزاء لعينات الأنسجة النباتية المتمردة

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...