Gostaríamos de agradecer as seguintes pessoas, sem cuja ajuda a coleção de tecidos de pinho não teria sido possível: Dr. Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, e Amanda Bouffier.

Parte 1: Colheita Árvore Depois que a árvore é selecionada e cortada, é importante trabalhar com o mesmo cuidado e tão rapidamente quanto possível. Como cada tipo de tecido diferente é colhida, devem ser colocados imediatamente em suas próprias embarcações nitrogênio líquido para evitar a contaminação cruzada de material da amostra. Este protocolo de isolamento do RNA é escalável. <ol><li> Cortar os parafusos em comprimentos de cerca de 0,5-0,75 m e com uma pontuação motosserra a casca em duas ou três lugares seguintes do eixo longitudinal do parafuso. </li><li> Utilizando um cinzel de madeira, o trabalho da borda da região marcou até a casca começa a se separar da madeira e continuar a trabalhar o cinzel enquanto puxa para trás na seção de casca até que ela se separa da haste. </li><li> Xilema secundário é colhida com uma navalha reta de ponta, de lado único raspando ao longo do eixo longitudinal do parafuso que tem sido descascada. Usar luvas de látex para minimizar a contaminação do tecido. </li><li> Floema, que está localizado na parte interna das seções de casca, é prontamente colhidas pelo manual peeling. </li><li> Madeira de reação é coletado do lado de membros após marcando-as com tinta spray para indicar sua orientação original com respeito no chão. </li><li> Membros são cortados em parafusos de m 1-2 e marcou em lados opostos ao longo do eixo longitudinal de acordo com as localizações aproximadas dos dois tipos de madeira de reação: madeira oposto (no lado superior do membro) e madeira de compressão (no fundo lado do membro). A casca é separada do membro, como descrito acima, exceto que apenas a casca que cobre cada tipo de madeira de reação é removida de uma vez. Xilema secundário ou floema é, então, coletadas como descrito acima e colocada em nitrogênio líquido. </li><li> Outras amostras, como agulhas, brotos e cones jovens, podem ser colhidas à mão ou usando tesouras de poda, conforme necessário. </li><li> Amostras coletadas congeladas em nitrogênio líquido deve ser colocado em sacos ou recipientes adequados marcados e embalados em gelo seco para a expedição para o laboratório. </li></ol> Parte 2: Processamento Freezer Moinho de Amostras <ol><li> Encha o reservatório de moinho Spex 6850 freezer com nitrogênio líquido e coloque a barra de impacto em um dos frascos de moagem e preencher com nitrogênio líquido para chill-pre. Deitar fora nitrogênio líquido e adicione a amostra para o frasco. </li><li> Certifique-se de que nenhum excesso de nitrogênio líquido permanece na câmara de moagem e que o gás nitrogênio em excesso é completamente liberada antes da tampa está sentado para selar a câmara. </li><li> Insira o frasco de moagem para a transportadora e fechar. </li><li> Amostras woody moinho para dois ciclos de 1 minuto / ciclo à definição da taxa de 14. </li><li> Use uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado para retirar a amostra moída (farinha de madeira) em um copo que foi pré-refrigerados e contém uma pequena quantidade de nitrogênio líquido. </li><li> Despeje a polpa de nitrogênio / amostra de líquido em um recipiente de armazenamento e coloque a -80 ° C até ser necessário. </li></ol> Parte 3: RNA Isolation, Dia 1 <ol><li> Coloque 20 mL de RNA do buffer de isolamento em um tubo Falcon 50 ml nivelado e acrescentar 400 brevemente β-mercaptoetanol vortex, mL, então o calor em banho-maria a 60 ° C. </li><li> Adicionar 4 g de tecido congelado a cada tubo. Tampa e agitar vigorosamente à mão seguido por vórtex por 10 segundos. </li><li> Adicionar um volume igual de clorofórmio para o tubo e inverter suavemente para misturar. Colocar o tubo em uma roda giratória e permitir end-over-end mistura por 5 minutos. </li><li> Decantar a mistura em um tubo de 50 mL de Ridge Oak e centrifugar a 12.000 (17.200 xg) rpm em um SS34 rotor de ângulo fixo por 5 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo Oak Ridge e adicionar uma metade do volume de clorofórmio. </li><li> Vortex por 1 minuto e continue misturando em uma roda giratória por 5 minutos. Centrifugar a 12.000 rpm (17,200 xg) em um ângulo de rotor SS34 fixo por 5 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa para novo tubo de Oak Ridge e adicionar uma metade do volume de clorofórmio. Vortex por 1 minuto. Centrifugar a 12.000 rpm (17,200 xg) em um ângulo de rotor SS34 fixo por 10 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa para um tubo de 50 mL de polipropileno de alta velocidade. Centrifugar a 10.000 rpm (11,900 xg) em um ângulo de rotor SS34 fixo por 20 minutos. </li><li> Decantar o sobrenadante do tubo Falcon em 50 mL e adicionar um quarto volume 10 M solução de LiCl para sobrenadante. Brevemente vortex e colocar a 4 ° C para a precipitação durante a noite. </li></ol> Parte 4: RNA Isolation, Dia 2 <ol><li> Buffer de calor SSTE em um banho de água 65 ° C antes de iniciar. </li><li> Verter a amostra LiCl-precipitado em um tubo de polipropileno eo pellet de RNA por centrifugação a 11.000 rpm em um ângulo de rotor SS34 fixo (14.450 xg) por 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Após a centrifugação,Deitar fora e descartar o líquido, e inverter os tubos em Kimwipes por aproximadamente 1 minuto. Pipeta de desconto em qualquer sobrenadante restante. </li><li> Ressuspender cada pellet em 800 mL de SSTE aquecido utilizando uma pipeta para misturar as amostras. Transferir a amostra em suspensão para tubos de 2 mL Ambion RNAse-free microcentrífuga. </li><li> Amostras de calor a 65 ° C por 2 minutos seguido por vórtex vigoroso para garantir a ressuspensão completa. </li><li> Adicionar um volume igual de fenol-clorofórmio, PH8, a cada tubo de amostra. Vortex cada amostra por 30 segundos e em seguida, girar em uma microcentrífuga a 14.000 rpm por 3 minutos </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo Ambion 2mL tubos de microcentrífuga RNAse-free, e adicionar um volume igual de clorofórmio. Vortex cada amostra por 30 segundos e girar na microcentrífuga a 14.000 rpm por 3 minutos. </li><li> Transferência de fase aquosa para tubos Phase Lock-Gel que tenham sido previamente preparado por microfuging a 11.000 rpm por 2 minutos. Adicionar uma metade do volume de clorofórmio e gentilmente pipeta para misturar. </li><li> Centrifugar a 11.000 rpm por 5 minutos e transferir a fase aquosa para novo 2mL Ambion tubos de microcentrífuga RNAse-free. </li></ol> Parte 5: Precipitação e RNA Wash Etanol <ol><li> Adicionar 50 mL de acetato de sódio 3,0 M, pH 4,8, e 1 mL de etanol a 100% para a fase aquosa. Vortex e precipitado em -80 ° C por 30 minutos ou durante a noite a -20 ° C. </li><li> Amostras de microcentrífuga a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, e aspirar cuidadosamente fora do sobrenadante. Não perturbar o pellet. </li><li> Lavar os pellets de RNA com 1 mL de etanol -20 ° C a 70% (v / v). Microcentrífuga a 14.000 rpm por 1 minuto e aspirado de fora o etanol. </li><li> Repita o passo 5.3. </li><li> Destampe a tubos e ar seco pellets no banco por 3-5 minutos. </li></ol> Parte 6: ressuspensão final e Quantificação <ol><li> Ressuspender cada pellet em 100 de água DEPC tratados mL. Misturar em vortex e incubar os tubos a 65 ° C por 2 minutos antes de colocar no gelo. Repita se necessário para garantir a ressuspensão da amostra. </li><li> Piscina como amostras, se desejar e fazer 50 mL de uma diluição de 1:10 em 10 mM Tris, pH 7,5, para a quantificação espectrofotométrica. Razão de absorvância para 260/280 e 260/230 são normalmente maiores do que 2,1 e 2,2, respectivamente. Isolamento do RNA rendimento varia de 60-120μg / g de tecido congelado. </li><li> Analisar amostras executando 1,5-2,5 mg RNA em um gel de agarose 1% em tampão TAE. Para mais amostras críticas, analisar o RNA usando um Agilent 2100 Bioanalyzer conforme instruções do fabricante. </li></ol> Resultados representativos: Rendimentos de isolamento de RNA de diferentes tecidos de coníferas faixa 60-120 mg / g tecido congelado com amostras woody normalmente produzindo em torno de 70-80g / g de tecido congelado. Índices de diagnóstico de 260/280 e 260/230 são normalmente maiores do que 2.1, e são bons indicadores de que a amostra de RNA é livre de qualquer contaminação ou fenólicos significativa de carboidratos, respectivamente. Amostras analisadas por eletroforese em gel de agarose corado pela EtBr deve mostrar três bandas distintas para 25S, 18S e RNA 5S (Figura 1). Determinar a estequiometria da 28S a 18S em gel de agarose é um tanto subjetiva, e fatores como a execução de condições para o gel, a coloração, ea carga de amostra podem ter um efeito. Em geral, o 28S: 18S relação parecerá ser&gt; 1,5. No entanto, algumas amostras de coníferas têm índices mais baixos. Por exemplo, após análise Agilent 2100 vimos vários casos de amostras de coníferas de diferentes tipos de tecidos, onde a estequiometria está mais perto de 1,2:1. Assim, uma aparente baixa 28S: 18S estequiometria por eletroforese em gel de agarose não indica necessariamente uma amostra de má qualidade. Folha, atirar, e amostras de cone, muitas vezes, têm adicional bandas distintas presente devido à chloroplastic RNAs ribossomais. EtBr manchada de materiais que não migram a partir da amostra bem ou bandas de alta massa molecular (&gt; 80-10 kb) geralmente indicam a contaminação do DNA genômico (Figura 2). Baixo peso molecular manchas massa nas proximidades ou abaixo da banda de 5S e coloração banda reduzida ribossomal 18S ou um aparente&gt; estequiometria 28S é um bom indicador de que o RNA degradação ocorreu (Figura 3). Na análise electrofograma Agilent 2100, a linha de base deve ser baixa e relativamente suave, com grandes picos correspondentes a 18S e 28S ribossomal ter RNAs 28S: 18S proporções que variam 1,2-2,0. A Agilent Número Integrity RNA (RIN) valor pode ser um melhor indicador de qualidade de RNA e deve ser pelo menos 7 ou superior para RNA que está a ser utilizado para a preparação de alvos microarray. A Figura 4 mostra uma típica Agilent 2100 electroferograma de RNA xilema com uma 28S: 18S proporção igual a 1,4 e um valor RIN de 8,6 enquanto a Figura 5 mostra um xilema pobres RNA prep ter uma linha de base muito alta e degradação perceptível como revelado pela 28S: 18S ratio igual a 0,65 e um valor de 3,4 RIN. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Gel Agarose análise de RNA de alta qualidade de pinho. Raia 1, NEB 1 kb padrão, Lane 2 mostra um típico isolamento do RNA total de xilema secundário com pinheiros loblolly característica 28S ribossomal, 18S, 5S e 28S bandas e aparente: a relação 18S&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gel Agarose análise da amostra de RNA de pinheiros contaminadas com DNA genômico. Raia 1, NEB 1 kb padrão, Lane 2, amostra de RNA xilema mostrando a contaminação do DNA genômico. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Gel Agarose análise de amostra de pinheiro mostrando RNA degradação e contaminação com DNA genômico. Raia 1, NEB 1 kb padrão, Lane2, amostra xilema RNA mostrando a contaminação e degradação do DNA genômico RNA grave. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Agilent electrofograma 2100 de RNA total xilema isolados utilizando o método descrito no xilema mudas de pinus. 28S: 18S é igual a relação de 1,4, valor igual a 8,6 RIN <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Agilent 2100 electroferograma de RNA total de ponta apical mostrando severa degradação e contaminação genômica. 28S: 18S é igual a relação de 0,65, valor igual a 3,4 RIN

<ol>
	<li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees.">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Sim&#369;es, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray.">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li></ol>

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de espécies de coníferas pode ser uma tarefa difícil, dado os altos níveis de compostos fenólicos e polissacarídeos encontrados em tecidos lenhosos. Começando com o protocolo desenvolvido por Chang et al. (1), descobrimos que a extração de mais rigoroso e limpar passos conduzem ao isolamento consistente de muito alta qualidade RNA total do woody woody vários e não-tecidos amostrados de uma grande variedade de espécies de coníferas. Este vídeo tem demonstrado nã...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA Isolation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>C298-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15509-037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10M LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>SSTE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol-chloroform (pH8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Oak Ridge High Speed Teflon Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-16B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene 50mL High Speed Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-10K</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>#21008-939</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#2302830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion, Inc.</td>
<td>#AM12425</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species

Tecidos isolados de espécies de coníferas, particularmente aqueles que pertencem à família Pinaceae, como o pinus taeda (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), contêm altas concentrações de compostos fenólicos e polissacarídeos que interferem com a purificação de RNA. Isolamento de RNA de alta qualidade destas espécies requer procedimentos rigorosos de recolha de tecidos no campo eo emprego de um protocolo de isolamento de RNA composto de várias etapas de extração orgânica, a fim de isolar o RNA de qualidade suficiente para microarray e outras análises genômicas. O isolamento de RNA de alta qualidade a partir do campo de coleta de amostras de pinheiro pode ser um desafio, mas várias modificações para o tecido padrão e procedimentos de isolamento do RNA melhorar significativamente os resultados. A extensão da degradação geral RNA aumenta se as amostras não são devidamente recolhidos e transportados do campo, especialmente durante grande escala colheitas. Rendimentos totais RNA pode ser aumentada significativamente por amostras de pulverização em uma fábrica de nitrogênio líquido freezer antes de RNA de isolamento, especialmente quando as amostras provenientes de tecidos lenhosos. Isto é principalmente devido à presença de agentes oxidantes, tais como compostos fenólicos e polissacarídeos que estão presentes em níveis elevados em extratos de tecidos de espécies lenhosas mais coníferas. Se não forem removidos, esses contaminantes podem transitar levando a problemas como a degradação de RNA, que resultam em baixo rendimento e uma má qualidade da amostra de RNA. Transição de compostos fenólicos, bem como polissacarídeos, também pode reduzir ou mesmo eliminar completamente a atividade de transcriptase reversa ou polimerase outros comumente utilizados para a síntese de cDNA. Em particular, RNA destinado a ser usado como modelo para double-stranded síntese de cDNA na geração de bibliotecas de cDNA, single-stranded síntese de cDNA por PCR ou qPCR, ou para a síntese de materiais alvo microarray deve ser da mais alta qualidade se os pesquisadores esperam para obter melhores resultados. Técnicas de isolamento de RNA comumente empregados para muitas outras espécies de plantas são muitas vezes insuficientes na sua capacidade de remover estes contaminantes a partir de amostras de coníferas e, portanto, não produzem RNA total de amostras adequadas para manipulações a jusante. Neste vídeo podemos demonstrar os métodos para a coleta de campo de tecidos de coníferas, começando com a derrubada de uma árvore anos quarenta, para a colheita de floema, xilema secundário e xilema de madeira de reação. Nós também demonstramos um protocolo de isolamento de RNA que tem consistentemente rendeu RNA de alta qualidade para posterior manipulação enzimática.

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An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Muitos tecidos vegetais, incluindo floema e xilema do pinheiro (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), contêm altos níveis de compostos fenólicos e polissacarídeos que interferem com a purificação de RNA. Esta apresentação discute técnicas para a colheita de tecidos cultivados em campo e isolamento de RNA de qualidade suficiente para microarrays e outras análises genômicas.

Um método melhorado de isolamento de RNA Pine Loblolly ( P. taeda L.) e espécies de coníferas Outros

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

13.7K visualizações.  University of Georgia (UGA). Muitos tecidos vegetais, incluindo floema e xilema do pinheiro ( Pinus taeda L.), contêm altos níveis de compostos fenólicos e polissacarídeos que interferem com a purificação de RNA. Esta apresentação discute técnicas para a colheita de tecidos cultivados em campo e isolamento de RNA de qualidade suficiente para microarrays e outras análises genômicas.