وأيد العمل في جزء من المعهد الوطني للصحة (R01GM079688 ، R21RR024439 وR21GM075838) ، المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET 0941055) ، ومؤسسة جامعة ولاية ميشيغان.

1. بمعزل عن اللجان الدائمة الجرذ تم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة 6-8 الاسبوع الفئران سبراغ داولي الإناث القديمة كما هو موضح سابقا 1 و 2. يمكن عزل اللجان الدائمة التمسك سطح البلاستيك وتوسيع بسهولة في المختبر خلال الثقافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت الحيوان الى غرفة التخدير والخدر لنحو خمس دقائق. أثناء التخدير ، ومراقبة معدل التنفس ، وامض والنشاط الحركي. إزالة الحيوان من الغرفة على الفور بعد أن توقف عن النشاط الحركي ومعدل وامض أصبحت نادرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوانات الخناق على محطة التشغيل وقتل الحيوان خلع عنق الرحم. قطع femurs وtibias من أطرافهم مرة أخرى ، إزالة الجلد والعضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع femurs تشريح وtibias في 70 ٪ الأيزوبروبانول لبضع ثوان ، ونقل إلى D - 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة الأحيائية ، ونقلت وfemurs tibias إلى صحن يحتوي على DMEM 10cm. وعقدت بعد ذلك كل عظم مع ملاقط وخفضت طرفي مفتوحة مع مقص. إرفاق الإبرة إلى حقنة 22G 3ml وملء مع DMEM ، ثم طرد النخاع في أنبوب 50ml بإدخال إبرة إلى نهاية واحدة مفتوحة من العظام. كرر 2 ~ 3 مرات لكل العظام. عندما تم الحصول على جميع الكوسا ، resuspend الخلايا وتمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70μm لازالة الانقاض والركام العظم الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في الخلايا 200G ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وإزالة طاف بواسطة الطموح. Resuspend الخلايا في المتوسط ​​MSC 25ml (DMEM تحتوي على 10 ٪ و 1 ٪ FBS القلم بكتيريا). وكان المصنف 10ML تعليق خلية في كل ثقافة 10cm طبق لما مجموعه اثنين من الأطباق. الحفاظ على ثقافة الأطباق في 37 درجة مئوية و 5 ٪ للثاني حاضنة 2 1 2 أسابيع ~. تم تغيير كل المتوسطة 2 ~ 3 أيام. </li></ol> 2. إثراء اللجان الدائمة الجرذ وقد تم استخدام عدد من البروتينات السطحية لتخصيب اللجان الدائمة ، بما في ذلك CD54 ، CD90 ، CD105 ، CD271 CD73 و 3-5. في دراستنا ، واستخدمنا CD54 CD90 كعلامات لتخصيب اللجان الدائمة عن طريق الفرز الخلية المغناطيسي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت الخلايا نحو 80 ٪ confluency ، نضح على المديين المتوسط ​​وإضافة 4 ~ 5ml التربسين - EDTA لكل طبق. وضع الأطباق العودة إلى الحاضنة واحتضان لحوالي 5 دقائق للسماح للمفرزة الخلية. مرة واحدة وفصل الخلايا ، إضافة كمية متساوية من مستنبت لتعطيل التربسين. جمع التعليق الخلية في أنبوب 15ml وخلايا تدور في اسفل 200G ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوات التالية تصف كيفية تخصيب اللجان الدائمة بواسطة علامات سطح ثنائي CD54 CD90 وفقا لدليل لفصل الخلايا باستخدام IMagnet دينار بحريني. وكان بيليه معلق الخلية في الخلية تلطيخ العازلة (3 ٪ FBS الحرارة المعطل في D - 1X PBS) بمبلغ 20 مليون خلية / مل. وأضاف Biotinylated CD54 الأجسام المضادة (0.25μg لكل مليون الخلايا) وbiotinylated CD90 الأجسام المضادة (0.15μg لكل مليون الخلايا) والمختلط بلطف مع التعليق الخلية. بعد الحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة ، تم غسلها الخلايا المسمى مع وحدة تخزين فائض العازلة 1X ايماج دينار بحريني. كانت تغزل الخلايا المسمى في اسفل 200G ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة من الجسيمات ايماج دينار بحريني streptavidin بدقة ، إضافة جزيئات الخلايا 40μl لكل 10 ملايين نسمة. مزيج من الجسيمات مع الخلايا المسماة بدقة واحتضان الخلايا في 6 ~ 12 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذا يسمح للجزيئات streptavidin ربط biotinylated مكافحة CD54 CD90 والمعادية ، والتي لا بد أن البروتينات السطحية CD54 CD90 وعلى التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال فترة الحضانة ، والتسمية أنبوب اختبار الجولة القاع لجمع جزء إيجابية. بعد مرور فترة الحضانة ، وتحقيق حجم العلامات إلى 20 مليون خلية / مل مع العازلة 1X ايماج دينار بحريني ونقل الخلايا المسمى إلى أنبوب جمع إيجابية الكسر. مكان الكسر إيجابية على أنبوب للIMagnet دينار بحريني ، والسماح لها بالبقاء لمدة 6 دقائق ، ثم إزالة طاف مع ماصة باستير أنبوب زجاجي مع الكسر لا تزال إيجابية على IMagnet دينار بحريني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جزء أنبوب إيجابية من IMagnet دينار بحريني ووضعه على الجليد. إضافة 1ml الجليد الباردة 1X العازلة ايماج دينار بحريني والخلايا resuspend عن طريق خلط لطيف. وضع أنبوب ليعيدوه الى IMagnet دينار بحريني ، والسماح لها بالبقاء لمدة 2 دقيقة 4 ~. إزالة طاف مع ماصة جديدة باستور الزجاج. تكرار الغسيل كما هو موضح في وقت واحد أكثر من 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب من IMagnet دينار بحريني والخلايا resuspend في مستنبت ، والبذور one 75cm 2 قارورة للحفاظ على الخلايا وطبق 10cm عن التدفق الخلوي. </li></ol> 3. التحقق من التعبير ماركر السطحية بواسطة التدفق الخلوي أجري تحليل تدفق الخلوي للتحقق من الخلايا التي حصلنا عليها والتعبير عن CD54 CD90. تم استخدام HSC CD45 علامة لتأكيد أنه تم استنفاد اللجان الدائمة للHSCs. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصبح الخلايا ~ متموجة 80 ٪ ، يعرض للتريبسين الخلايا مع التربسين - EDTA وجمع الخلايا في أنبوب 15ml. الطرد المركزي في 4 ، 200G درجة مئوية لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وطافح مع الخلايا D - 1X PBS مرة واحدة. Resuspend الخلايا في خلية تلوين العازلة (D - 1X PBS التي تحتوي على 2 ٪ و 0.05 ٪ FBS أزيد الصوديوم) إلى التركيز النهائي من 5 ~ 10 مليون خلية / مل والحفاظ على الخلايا على الجليد. تعليق قسامة الخلية 100μl في أنابيب six المسمى (1 الخلايا فقط ؛ 2 isotype السيطرة IgG2a ؛ السيطرة Isotype 3 IgG1 ؛ CD45 4 و 5 CD54 ؛. CD90 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عناصر تحكم isotype والأجسام المضادة الأولية بتركيزات مناسبة (IgG2a وIgG1 : 20μl لكل مليون خلايا ؛ CD45 : 0.5μg لكل مليون خلايا ؛ CD54 : 0.25μg لكل مليون خلايا ؛ CD90 : 0.15μg لكل مليون خلايا) ، واحتضان عند درجة 4 ل 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع D - 1X PBS مرتين ثم resuspend الخلايا في خلية 100μl العازلة تلطيخ. إضافة SA - PE (streptavidin - فيكوإيريترين ، واستخدام الخلايا 0.15μg لكل مليون) ، واحتضان عند 4 لمدة 30 دقيقة في الظلام درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا المسمى مع D - 1X PBS مرتين. Resuspend الخلايا في خلية 400μl تلطيخ العازلة ونقل إلى أنبوب الصقر للتحليل التدفق الخلوي. </li></ol> 4. الفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة اللجان الدائمة هي مجموعة من السكان غير متجانسة مؤلفة من مجموعات سكانية فرعية مختلفة مع الشكل مختلفة من الخلايا ، ومعدل النمو ، فضلا عن القدرة على التفريق 6. ومع ذلك ، فإن جميع الشرائح السكانية تعبر عن العلامات المعروفة MSC وبالتالي فإنه ليس من المجدي استخدام علامات لفصل خارج هذه المجموعات السكانية الفرعية. لذلك ، طبقنا اسطوانات استنساخ لفصل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة ، والتي هي مستعمرات الخلايا التي شكلتها واحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا بنحو 50 خلية لكل 100 ~ 10cm الطبق. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 2 أسابيع ~. خلال هذه الفترة ، ودراسة مستعمرات معزولة بشكل جيد مع مجهر مقلوب. بمجرد أن وصلت إلى حجم مستعمرات كبيرة بما يكفي (أكثر من 100 أفضل الخلايا في كل مستعمرة) ، وعلامة على المستعمرات مع sharpie في قاع الطبق. عند اختيار مستعمرة لتكون وضعت ، تأكد من عدم وجود المستعمرات المحيطة واحدة التقطت قرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة ويغسل مرة واحدة مع طبق D - 1X PBS. التقط اسطوانة الاستنساخ العقيمة مع ملقط معقم ووضعه برفق حول مستعمرة ملحوظ. كرر هذا حتى جميع المستعمرات وضعت اسطوانة الاستنساخ وضعها فوق. ينبغي للمستعمرات التقطت تكون بعيدة عن كل تلك الأخرى التي تحتوي كل اسطوانة الاستنساخ واحدة فقط مستعمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100μl التربسين - EDTA لكل اسطوانة الاستنساخ ووضع الطبق إلى حاضنة لمدة 5 دقائق ~. بعد 5 دقائق ، والتحقق من الخلايا تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت تصل التقريب. عندما تصل الخلايا رفعت ، إضافة كمية متساوية من مستنبت لتعطيل التربسين. مزيج تعليق خلية مع micropipettor 200μl ونقل التعليق الخلية التي تحتوي على طبق 60mm 3ml مستنبت prewarmed. صحيح تسمية الأطباق ووضعها من جديد في الحاضنة. تعقب التغييرات الشكلية على مدى الأيام القليلة القادمة. </li></ol> 5. ممثل النتائج وفقا للبروتوكول وصفها في الجزء اللجان الدائمة للعزلة الفئران ، وينبغي أن اللجان الدائمة ملتصقة البلاستيك تكون مرئية في اليوم التالي بعد الطلاء. كما الخلايا تستمر في الانتشار ، ينبغي أن تبدو وكأنها خلايا متكدسة الخلايا هو موضح في الشكل 1A. عندما تصل الخلايا ~ 80 ٪ confluency (1B الشكل) ، ويمكن أن يتم خارج subculturing. خلال ثقافة فرعية ، استخدمت التربسين - EDTA لفصل الخلايا والخلايا رفع صغيرة ومستديرة كما هو مبين في الشكل 1C. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. على النقيض من الصور مرحلة من اللجان الدائمة الفئران. (A) مندمج MSCS. غالبية الخلايا المغزل مثل نجمة أو مثل. (ب) اللجان الدائمة حوالي 80 ٪ confluency. (C) ورفعت بعد trypsinization خلايا صغيرة ومستديرة. حالما يتم التخصيب اللجان الدائمة عن طريق الفرز الخلية المغناطيسي ، يتم تنفيذ تحليل تدفق الخلوي للتحقق من التعبيرات علامة السطح. إذا تخصيب جيدة ، يجب أن تظهر خلايا تلطيخ إيجابية في مكافحة علامات MSC CD54 CD90 ولكن السلبية ضد علامة HSC CD45 (الشكل 2). وتستخدم عناصر التحكم Isotype IgG2a وIgG1 والضوابط سلبية. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. وصفت تحليل التدفق الخلوي من اللجان الدائمة للعلامات السطح. اللجان الدائمة مع أجسام مضادة ضد IgG2a (isotype الرقابة 1) ، IgG1 (isotype التحكم 2) ، CD45 ، CD54 CD90 و. وأعربت اللجان الدائمة وCD54 CD90 CD45 ولكن لا. عندما تكون خلايا المصنف في كثافة نسيلي الصحيح ، وينبغي أن يرتفع من مستعمرات الخلايا واحد. 3A الرقم يمثل مستعمرة شكلتها خلية واحدة. ويمكن عندئذ أن تستخدم اسطوانات استنساخ لفصل ويمكن تربيتها في المستعمرات والخلايا المشتقة من المستعمرات بشكل منفصل. والرقم 3B 3C تمثل الخلايا المشتقة من اثنين من المستعمرات الفردية. الخلايا المشتقة من مستعمرة 1 هي مثل مغزل (الشكل 3B) في حين أن الخلايا المشتقة من مستعمرة 2 مستديرة الشكل (3C). <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تشكيل اللجان الدائمة ومستعمرة من قبل احد مستعمرة الخلايا المشتقة. اللجان الدائمة مثقف في نسيلي كثافة المستعمرات الفردية النموذج. ويمكن فصل هذه المستعمرات التي اسطوانات الاستنساخ والخلايا من مستعمرات مختلفة يمكن تربيتها بشكل منفصل. (أ) مستعمرة ممثل شكلتها اللجان الدائمة عندما مطلي في كثافة نسيلي. (ب) المغزل مثل الخلايا المشتقة من مستعمرة. (C) مشتقة من خلايا جولة أخرى مستعمرة.

<ol>
	<li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells.">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li><li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells.">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells:+from+basic+biology+to+clinical+applications.">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li><li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells.">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li><li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells.">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li></ol>

هذا البروتوكول يصف كيفية عزل وإثراء MSCS. وهو مدرج أيضا طريقة لفصل الخلايا مستعمرة واحدة مشتقة. هناك العديد من الخطوات التي تعتبر مهمة للفصل العزلة ، والإثراء ، ومستعمرة ناجحة. أثناء القيام العزلة خلية من الفئران ، فمن المستحسن لتصفية من خلال مصفاة خلية أو شبكة النايلو...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1X D-PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11885-084</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>26140-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Imagnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>552311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin mouse IgG2a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>555572</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin mouse IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>555747</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD54</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL054B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD90</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL005B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD45</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL001B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Imag buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>552362</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round-bottom tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>557812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SA-PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D systems</td>
<td>F0040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cloning cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2059</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and enrichment of rat mesenchymal stem cells (mscs) and separation of single-colony derived mscs

اللجان الدائمة هي مجموعة من الخلايا الجذعية البالغة التي هي مصدر واعد للتطبيقات علاجية. يمكن عزل هذه الخلايا من نخاع العظم ويمكن فصلها بسهولة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) بسبب تمسكهم البلاستيك. هذا البروتوكول يصف كيفية عزل من اللجان الدائمة وtibias femurs الفئران. وإثراء للخلايا معزولة ضد اثنين من علامات سطح اللجان الدائمة CD54 CD90 والفرز من قبل خلية المغناطيسي. ثم تأكدت من علامات التعبير والسطحية CD54 CD90 عن طريق تحليل التدفق الخلوي. كما تم تضمين علامة HSC CD45 للتحقق مما إذا كانت اللجان الدائمة استنزاف فرزها من HSCs. اللجان الدائمة هي بطبيعة الحال غير متجانسة تماما. هناك مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي تحتوي على أشكال مختلفة ، وقدرات الانتشار التمايز. هذه المجموعات السكانية الفرعية تعبر عن جميع اللجان الدائمة وعلامات معروفة لم تكن هناك علامة فريدة لتحديد الشرائح السكانية المختلفة. لذلك ، نهجا بديلا لفصل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة باستخدام اسطوانات استنساخ لفصل واحد مستعمرة الخلايا المشتقة. ويمكن عندئذ الخلايا المشتقة من المستعمرات واحد يكون مثقف وتقييمها بشكل منفصل.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs at JoVE.com

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

وكانت الفئران المعزولة من اللجان الدائمة وfemurs tibias وإثراء ثم فرز الخلايا المغناطيسية. وتأكدت الخلايا فرز للتعبير عن السطح علامات التدفق الخلوي. وكانت أيضا هذه الخلايا المستزرعة في كثافة نسيلي لتشكيل المستعمرات واحدة ثم تم فصل هذه المستعمرات التي اسطوانات الاستنساخ.

العزلة والإثراء من خلايا فأر الجذعية الوسيطة (MSCS) والفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

isolation-enrichment-rat-mesenchymal-stem-cells-mscs-separation

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

28.3K Views.  City of Hope Cancer Center. وكانت الفئران المعزولة من اللجان الدائمة وfemurs tibias وإثراء ثم فرز الخلايا المغناطيسية. وتأكدت الخلايا فرز للتعبير عن السطح علامات التدفق الخلوي. وكانت أيضا هذه الخلايا المستزرعة في كثافة نسيلي لتشكيل المستعمرات واحدة ثم تم فصل هذه المستعمرات التي اسطوانات الاست...

Video: Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

العزلة والحيوان التوسع الحرة المصل الحبل السري الإنسان المستمدة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCS) وغشائي خلايا مستعمرة السلف التشكيل (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

العزلة وتوصيف هويشت منخفضة CD45 السلبية ماوس خلايا الرئة الجذعية الوسيطة

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

عزل CD146<sup&gt; +</sup&gt; خلايا المقيم الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية من الجرذ الرئتين

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) provide a consistent ex vivo cellular system that are functionally like that of in vivo adipocytes. Use of ADSCs in biomedical research allows for cellular investigation of adipose tissue metabolic regulation and function. ADSC differentiation is necessary for adequate adipocyte expansion, and suboptimal differentiation is a major mechanism of adipose dysfunction. Understanding changes in ADSC differentiation is crucial to understanding the development of metabolic dysfunction and disease. The protocols described in this manuscript, when followed, will yield mature adipocytes that can be used for several in vitro functional tests to assess ADSC metabolic function, including but not limited to assays measuring glucose uptake, lipolysis, lipogenesis, and secretion. Rhesus macaques (Macaca mulatta) are physiologically, anatomically, and evolutionarily similar to humans and as such, their tissues and cells have been used extensively in biomedical research and for development of treatments. Here, we describe ADSC isolation using fresh subcutaneous and omental adipose tissue obtained from 4&#8211;9-year old rhesus macaques. Adipose tissue samples are enzymatically digested in collagenase followed by filtration and centrifugation to isolate ADSCs from the stromal vascular fraction. Isolated ADSCs are proliferated in stromal media followed by approximately 14&#8211;21 days of differentiation using a cocktail of 0.5 &#956;g/mL dexamethasone, 0.5 mM isobutyl methylxanthine, and 50 &#956;M indomethacin in stromal media. Mature adipocytes are observed at approximately 14 days of differentiation. In this manuscript, we describe protocols for ADSC isolation, proliferation, and differentiation in vitro. Although, we have focused on ADSCs from rhesus macaque adipose tissue, these protocols can be utilized for adipose tissue obtained from other animals with minimal adjustments.

In this article, we describe isolation of rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) using an enzymatic tissue digestion protocol. Next, we describe ADSC proliferation which includes cell detachment, counting and plating. Lastly, ADSC differentiation is described using specific adipogenic inducing agents. Additionally, we describe staining techniques to confirm differentiation.

عزل وتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية المشتقة من المكاك الريسوس الدهنية

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية وتوصيفها

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

تسليط الضوء على المؤلف: عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...