وقد تم تطوير هذا البروتوكول في مختبرات دود جين توماس وJessell ومسدين اندرو. قرر العديد من الناس ، بما في ذلك باسلر كونراد ، Calof آن ، Edlund توماس هاملتون فيل ، Karagogeos دومنا ، ارييل رويز Altaba ط ويامادا Toshiya كيفية explants ثقافة النخاع الشوكي في الكولاجين. رائدة Marysia Placzek ومارك لافين تيسييه - باستخدام تقنية النمو في محور عصبي من explants المختبر كوسيلة لتحديد الجزيئات التوجيه محور عصبي. ويدعم العمل في المختبر بتلر من المنح المقدمة من مارس من الدايمات وNS063999 R01 من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS.

الجزء 1 : إعداد الركام من الخلايا COS Transfected باستخدام قطرة الشنق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> COS - 7 البذور (COS) الخلايا في أطباق ثقافة 35mm. عندما تصل إلى 80 ٪ confluency ، 1μg transfect التعبير البلازميد في الخلايا باستخدام Lipofectamine2000 وفقا لبروتوكول الصانع ق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد شنقا قطرات ، نضح في والمتوسطة ترنسفكأيشن شطف transfected COS 1ml من الخلايا مع حلول التخزين المؤقت 1X الفوسفات (PBS). علاج الخلايا مع 0.5ml من انزيم خالية من الخلايا تفارق المتوسطة لمدة 15 دقيقة. إضافة 1ml من محلول OPTI - MEM المصل + + 1X البنسلين / الستربتوميسين / الجلوتامين (P / S / G) 10 ٪ بقري جنيني (FBS) لمنعها من التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متمزج الخلايا لإزالتها من على سطح الطبق والثقافة ، ونقل إلى أنبوب مخروطي 15ml. تدور لمدة 2 دقيقة في 2000K إلى خلايا بيليه. إزالة وطاف بيليه resuspend في 100μl من OPTI - MEM 1X + P / S / G FBS 10 ٪ +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقعة قطرات 20μl متعددة في الداخل غطاء صحن الثقافة 35mm ، عكس غطاء ووضعت على رأس الجزء السفلي من صحن وتترك في الحاضنة 37 درجة مئوية لعدة ساعات حتى خلايا الكلي. </li></ol> الجزء 2 : إعداد الظهرية Explants النخاع الشوكي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح أجنة الفئران E11 من رحم الأم والحفاظ على الجليد في L15 المتوسطة لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بإبرة التنغستن شحذ ، وإزالة قسم من الجزء 4-6 جذع كل جنين ، من المنطقة فورا دون تبرعم forelimb. باستخدام ماصة بلاستيكية ، وجمع القطع الأنسجة في بئر واحدة من صحن 4 - نونك جيدا والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم تشريح جميع شرائح الجنين ، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل القطع إلى حل 1ml L15 + 1mg dispase في الثانية بشكل جيد للطبق نونك. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد مدة 5 دقائق. لا يحضن على قطع الأنسجة مع dispase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة ، إضافة 0.5ml من مصل الماعز المعطل الحرارة العادية (HIGS) إلى نحو 10ML من L15 في طبق بتري ودوامة لالمزيج. نقل 1ml من هذا الحل في 1 / 3 جيد للطبق نونك ونقل قطعة النسيج في هذا الحل عندما انتهت الحضانة. تبقي على الجليد. ملاحظة : تشريح لاحقة سوف يكون أسهل إذا ما سمح للقطعة النسيج الى &quot;الراحة&quot; على الجليد لمدة ساعة. </li></ol> الجزء 3 : الكولاجين الاشعال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10X الحد الأدنى 40μl الوسيلة الأساسية ل360μl الكولاجين ، مزيج بسرعة وبدقة من قبل لفترة وجيزة vortexing عبها أو الأنبوب. تدور بسرعة في أسفل picofuge. وسوف يكون الحل الأصفر حافظ على الجليد قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيكربونات الصوديوم إضافة يكفي 0.8M (NaHCO 3) لتحويل حل الكولاجين البرتقالي قليلا (انظر الملاحظة أدناه). مرة أخرى ، مزيج بسرعة وبدقة من قبل عبها ، وتدور باستمرار لفترة وجيزة في picofuge. إذا كان هذا الحل يبقى الوردي بعد الاختلاط ، قمت بإضافة الكثير من NaHCO (3) وسوف تحتاج إلى البدء من جديد مع أنبوب جديدة من الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة هو معبي الحل الكولاجين. وسوف تظل سائلة على الجليد ، ولكن سوف يصلب ضمن حوالي 5 دقائق (تحول الوردي) عند تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20μl بقعة من الكولاجين في كل بئر من صحن 4 - جيدا نونك. استخدام غيض من ماصة الخاص ، انتشرت لتشكيل الكولاجين الصغيرة &quot;وسادة&quot;. السماح للالكولاجين وضعت في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> ملاحظة : إن المبلغ المحدد للNaHCO 3 سوف تحتاج إلى معاير لكل دفعة من الكولاجين. بدء منخفضة (11μl) ثم إضافة 0.5 1μl متدرج حتى الحل هو الظل طفيف من البرتقال. &quot;الحق&quot; المبلغ هو عادة 1ul أقل من أصغر مبلغ 3 NaHCO التي من شأنها أن تحول الوردي الكولاجين. كمية NaHCO 3 لا مقياس خطيا صعودا أو هبوطا. الجزء 4 : تشريح الظهرية Explants الحبل الشوكي وضعية لهم خلية الركام في مصفوفة COS الكولاجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة التنغستن شحذ حديثا وزوج من غرامة ملقط (# # 5 أو 55) ، إزالة الأديم المتوسط ​​المحيطة الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض مواز لوحة الكلمة مع الإبرة التنغستن وإزالة بعناية الخامس بطني من الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطر من يزدرع الظهرية الشوكي ، والتأكد من أن يتم قطع حواف نظيفة كما ممكن. إعادة تقليم الحواف ، إذا لزم الأمر. نقل كل يزدرع الفقري الظهري على منصات منفصلة باستخدام الكولاجين الفم ماصة مزودة أنبوب زجاجي الشعرية وانسحبت إلى تقريبا. 0.5mm في القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض مجموع الخلايا COS transfected في ساحات العرض تقريبا نفس الحافة الجانبية لازدراع الشوكي الظهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل واحد من هذه الميادين على لوحة الكولاجين مع يزدرع الشوكي الظهري ، وذلك باستخدام ماصة الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة مع الفم ، ونضح إيقاف أي السائل الزائد باستخدام ماصة الفم. لا أكثر من نضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 4μl الكولاجين معبي تستقر على الوسادة ، وباستخدام إبرة التنغستن، نقل على الكولاجين explants مباشرة دون لمس الأنسجة. عن طريق تحريك الإبرة التنغستن في الكولاجين المحيطة explants ، explants توجيه بحيث أن مجموع الخلايا COS المجاورة لحافة الوحشي يزدرع الشوكي الظهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الكولاجين وضعت ، كرر تطبيق 4μl الكولاجين لضمان أن يتم explants المغطى تماما في الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نسيج الثقافة هود ، إضافة 0.5ml من 1xP/S/G + OPTI - MEM والثقافة لساعات 30-40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> explants الإصلاح لمدة 45 دقيقة مع 0.5ml بارافورمالدهيد 4 ٪ في 1xPBS ، والحفاظ على لوحة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين مع 0.5ml حل حجب 1xPBS + 0.1 ٪ تريتون - X100 HIGS +1 ٪ (PBTN). كتلة عند 4 درجة مئوية لمدة بضع ساعات على الأقل ، ويفضل الحضانة بين عشية وضحاها ومن ثم العملية المناعية. </li></ol> الجزء 5 : التصور من محاور عصبية صواري بواسطة المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حظر في PBTN ، قطع explants للخروج من لوحة 4 بشكل جيد مع ملقط ووضعها في صحن 48 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200μl الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لتصور المحاوير صواري ، استخدام حل 01:06 من الأجسام المضادة لمكافحة Tag1 الماوس. لتحديد ما إذا كان ترنسفكأيشن كانت ناجحة ، وتشمل أيضا الأجسام المضادة الأولية التي يجري اختبارها ضد أي جزيء إشارة أو حاتمة ذات الصلة إذا كان جزيء يشير حاتمة المفتاحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل عينة لمدة 5 ساعات في 1 × PBTN في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200μl من الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إذا كانت تستخدم لمكافحة Tag1 الأضداد والأجسام المضادة الأولية ، واستخدام الماوس الماعز الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الثانوية المضادة بالإضافة إلى إما FITC أو Cy3. إذا باستخدام ضوء الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى FITC الحساسة أو Cy3 ، والحفاظ على طبق ال 48 المشمولة في احباط جيدا من هذه النقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل عينة 5 × 1 ساعة في كل PBTN في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل يزدرع إلى شريحة الاكتئاب 3 - جيدا ، وإزالة السائل الزائد ، جبل في وسط Vectashield وساترة. متجر في مربع آمن في ضوء إما 4 أو درجة مئوية -20 درجة مئوية. </li></ol> الجزء 6 : صور ممثل Explants في تجربة ناجحة ، وسوف يزدرع التجميعية COS تبقى المجاورة لبعضها البعض وعدم الانجراف بعيدا مثل الكولاجين مجموعات. لن يكون هناك نمو زائد الحد الأدنى من المحاور ؛ فرط محواري كبيرة تشير إلى أنه تم تربيتها في العمود الفقري الظهري يزدرع لفترة طويلة جدا. لن يكون هناك الفقاعات متزايدة من يزدرع ؛ blebbing يحدث إذا النسيج يأتي في اتصال مباشر مع الثقافة المتوسطة. ويتم تقييم قدرة جزيء يشير إلى إعادة توجيه محاور مبائر باستخدام المجهر. ويمكن قياس مدى إعادة توجيه محور عصبي عن طريق قياس زاوية متوسط ​​إعادة توجيه المحاور الأقرب إلى تجميع الخلية COS 3. كما هو مبين في الشكل 1 ، معربا عن الخلايا COS myc الموسومة BMP7 (الأزرق) + إعادة توجيه Tag1 المحاوير صواري (الأخضر) بعيدا عن مصدر BMP7 (1B الشكل) مشابهة للطريقة التي تعتبر أن لوحة يزدرع سقف يصد المحاوير صواري (الشكل 1A). خلايا COS تعبر عن مكافحة ناقلات يكون له تأثير على اتجاه المحاور صواري 3،4. كما وصفت هذه explants مع الأجسام المضادة لعامل النسخ Isl1 / 2 (الحمراء) ، الذي يزين الخلايا العصبية الحركية وinterneurons الظهرية. وبهذه النتيجة أول إشارة إلى أن أحد أعضاء الأسرة يتوسط BMP نشاط سطح اللوحة chemorepellent 3. <img src="/files/ftp_upload/1853/1853fig1tmb.jpg" border="0" /> الشكل 1 : الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1853/1853fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

العوامل الحاسمة التي تحدد النجاح في أداء هذا الاختبار هي أولا ، لا ينبغي أن تعامل مع الأنسجة dispase لفترة طويلة جدا ، وسوف ينتج مثل هذه المعاملة في النسيج تصبح لزجة جدا وبعد أن انخفضت قدرتها على البقاء. اثنين ، يجب أن تكون الكولاجين تستعد تماما ويحرص على الجليد قدر الإمك...

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

وقد المحاوير صواري الظهري في النخاع الشوكي الفقاريات 1 نظام النموذج الذي لا يقدر بثمن في توجيه اشارات لتحديد محور عصبي. هنا ، نحن تصف في الفحص المختبري &quot;، ومقايسة إعادة توجيه&quot; ، التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة تأثير خارجي من الإشارات والجوهرية في اتجاه المحاور صواري 2. وقد تم تطوير هذا الاختبار من قبل عدد كبير من الناس في مختبرات دود جين توماس وJessell ومسدين اندرو (انظر الاعترافات لمزيد من التفاصيل) وكانت تستخدم الإصدارات من هذا الاختبار للتدليل على أنشطة إعادة توجيه جزيئات مفتاح التوجيه محور عصبي ، بما في ذلك BMP في chemorepellent صفيحة سقف 3،4 والأنشطة chemoattractive من Netrin1 5 و القنفذ الصوتي (SHH) 6 في لوحة الكلمة في الحبل الشوكي. وتضم تشريح Explants 2-3 شرائح من ثلثي الظهرية للنخاع من يوم الجنينية (E) 11 الفئران والمثقفين في ثلاثة المواد الهلامية الكولاجين الأبعاد 7. explants E11 العمود الفقري الظهري يحتوي على الخلايا العصبية صواري المولود حديثا ، والتي يمكن تحديدها من خلال التعبير عنها محواري من بروتين سكري ، Tag1 8. على مدار ساعات 30-40 في الثقافة ، ولخص مسار محوار صواري في هذه explants الظهرية مع دوام شبيهة بتلك التي شوهدت في الجسم الحي. يمكن الطعن في هذا المسار من خلال وضع محواري الأنسجة إما اختبار أو التجميعية الخلية COS معربا عن جزيء مرشح يشير في اتصال مع واحدة من الحواف الجانبية للازدراع الظهرية. وسوف تمتد صواري المحاور في المنطقة المجاورة للأنسجة إلحاق تنمو تحت تأثير كل من لوحة السقف الذاتية وإشارات من الأنسجة الجانبي خارج الرحم. ويمكن قياس درجة التي يتم توجيه المحاوير صواري في ظل هذه الظروف. باستخدام هذا الاختبار ، فمن الممكن على حد سواء لفحص مدى كفاية إشارة خاصة إلى إعادة توجيه محاور صواري 3،4 فضلا عن ضرورة هذا إشارة لتوجيه مسار صواري 9.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

هذا الاختبار يقيم قدرة جزيء الإشارة ، هنا تخلقية بروتين العظام 7 (BMP7) ، إلى إعادة توجيه محاور صواري. هو مثقف لازدراع من الحبل الشوكي الجنينية الظهرية المتاخمة لمجموع إفراز الخلايا COS عوامل النمو مرشح. المحاوير صواري توجيه المتزايد داخل يزدرع هي التي تصور المناعية.

يعاير قدرة إنتشاري جزيئات إشارة إلى إعادة توجيه الجنينية محاور عصبية صواري العمود الفقري

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

assaying-ability-diffusible-signaling-molecules-to-reorient-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  University of Southern California. هذا الاختبار يقيم قدرة جزيء الإشارة ، هنا تخلقية بروتين العظام 7 (BMP7) ، إلى إعادة توجيه محاور صواري. هو مثقف لازدراع من الحبل الشوكي الجنينية الظهرية المتاخمة لمجموع إفراز الخلايا COS عوامل النمو مرشح. المحاوير صواري توجيه المتزايد داخل يزدرع هي التي تصور المناعية...

Video: Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

تصنيع جهاز ميكروفلويديك للتجزئة سوما الخلية العصبية والمحاوير

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

الفأر الجنينية الثقافة الرئة ، وهو نظام لتقييم الآليات الجزيئية من التفرع

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

اتش بوساطة إزالة الجزيئات الجينية في اشارة الى مثقف الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).