ابدأ بإعداد كمية كافية من مزيج التثقيب الكهربائي للتحكم والجين محل الاهتمام. قم بتوصيل غرفة قطب طبق بتري بالكهرباء. ثم باستخدام نصائح Microloader ، املأ إبر الحقن الدقيق ب 8 ميكرولتر من كل مزيج من مزيج التثقيب الكهربائي.
قطع أطراف الإبر قبل الاستخدام لتحقيق تدفق مستقر باستخدام مقص ناعم. تأكد من إزالة جزء صغير فقط من الطرف لأن الطرف الحاد والعريض يمكن أن يلحق أضرارا بالغة بالمواد العضوية. تحت المجهر ، اختر خمسة عضويات دماغية ذات حدود ناعمة وهياكل مرئية تشبه البطين.
ثم انقلها إلى طبق زراعة خلايا 35 ملم يحتوي على DMEM / F-12 مسخن مسبقا باستخدام طرف ماصة مقطوع 1000 ميكرولتر. الآن ، أدخل الإبرة بعناية من خلال جدار هيكل يشبه البطين وغمرها بمزيج التثقيب الكهربائي حتى تمتلئ بشكل واضح. لا تمارس ضغطا مفرطا على الهياكل الشبيهة بالبطين لتجنب الانفجار.
انقل عضويا دماغيا محقونا بالحقن الدقيق إلى حجرة قطب طبق بتري بكمية صغيرة من DMEM / F-12. رتب العضو العضوي بحيث تواجه أسطح الهياكل الشبيهة بالبطين المحقونة الدقيقة نحو القطب المتصل بالقطب الموجب للجهاز الكهربي. الآن ، قم بإلكتروب العضويات الدماغية واحدة تلو الأخرى باستخدام خمس نبضات بقوة 80 فولت لمدة 50 مللي ثانية لكل منها بفاصل زمني قدره ثانية واحدة.
إذا تم إجراء الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي في ظروف غير معقمة ، انقل المواد العضوية الكهربائية تحت غطاء التدفق الصفحي إلى طبق زراعة خلايا جديد 35 ملم مملوء ب DMEM / F-12 المسخن مسبقا. ثم استزرع المواد العضوية المكهربة في DM مع فيتامين A على شاكر مداري عند 55 دورة في الدقيقة في جو رطب من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، بعد التثقيب الكهربائي ، تحقق من المواد العضوية الدماغية بحثا عن التثقيب الكهربائي الناجح تحت مجهر مضان مقلوب تقليدي.
انقل المواد العضوية المكهربة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلتر باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 1000 ميكرولتر وقم بإزالة الوسط الزائد. أضف كمية كافية من 4٪ بارافورمالدهيد في DPBS واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، استنشق بارافورمالديهايد.
ثم أضف 5 ملليلتر من DPBS ، اهتز برفق ، واستنشق DPBS. قم بتخزين المواد العضوية في DPBS عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. بعد يومين من التثقيب الكهربائي ، تكون الخلايا الإيجابية ل GFP موضعية بشكل حصري تقريبا في منطقة البطين وهي إيجابية ل Pax6 ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا هي أسلاف قمي أو أسلاف قاعدية حديثي الولادة.
بعد 10 أيام ، يتم توطين الخلايا الإيجابية ل GFP في المناطق القاعدية. هذه الخلايا إيجابية أيضا ل Pax6 أو NeuN ، مما يدل على السلف القاعدي أو الخلايا العصبية ، على التوالي. يتم عرض إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للعضويات الدماغية المكهربة للحصول على انطباع عن التوزيع ثلاثي الأبعاد للخلايا الإيجابية ل GFP.
