Selection, Expansion, and Quality Control of hiPSCs Generated from Dermal Fibroblasts

للبدء ، خذ لوحة الخلايا الليفية الكهربائية ولاحظ تكوين مستعمرات hiPSC تحت مجهر تباين الطور الموضوعي 10x إلى 20x. مستعمرات hiPSC التي يبلغ قطرها 300 ميكرومتر ، وحدود مميزة ، ونسبة عالية من النوى إلى الجسم مناسبة للقطف. قبل الانتقاء ، قم بتغطية آبار 96 صفيحة بئر مناسبة لثقافة hiPSC ب 100 ميكرولتر من محلول الطلاء.

واحتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة ، ضع علامة على المستعمرات ذات الأهمية في الجزء السفلي من طبق ثقافة الخلية بقلم. للتحضير النهائي للوحة البئر 96 ، قم بإزالة محلول الطلاء وإضافة 100 ميكرولتر من وسط ثقافة hiPSC المسخن مسبقا ، والذي يحتوي على 10 ميكرومول من مثبط ROCK Y-27632 إلى كل بئر.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا وأضف وسط ثقافة hiPSC جديد تم تسخينه مسبقا يحتوي على 10 ميكرومول من مثبط ROCK Y-27632 قبل الانتقاء لإزالة الخلايا الميتة. اختر مستعمرات hiPSC باستخدام إبرة قياس وقسم المستعمرات إلى قطع صغيرة عن طريق رسم شبكة في كل مستعمرة. بعد ذلك ، استخدم مجهر تباين الطور للتحقق من تقسيم المستعمرات بنجاح إلى أجزاء.

أخيرا ، قم بنقل المستعمرات باستخدام ماصة سعة 100 ميكرولتر إلى لوحة البئر 96 المعدة ، مع تثبيت الماصة في وضع مستقيم فوق المستعمرة. اسمح للخلايا بالالتصاق طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون دون إزعاج. في اليوم التالي ، استبدل الوسط ب 200 ميكرولتر من وسط ثقافة hiPSC الطازج لإزالة مثبط ROCK Y-27632 ووضع الألواح مرة أخرى في الحاضنة.

راقب صفيحة البئر 96 وقم بتمييز الآبار بنسخ منتقاة بنجاح. يمكن توسيع الحيوانات المستنسخة المميزة وتجميدها في هذه المرحلة. نجحت صور تباين الطور في إعادة برمجة مستعمرات hiPSC ، وتم تقديم hiPSCs مختارة ، ومستعمرات متمايزة تلقائيا ، ومستعمرات غير hiPSC ، وثقافة hiPSC كثيفة للغاية.