Mouse Cardiac Progenitor Cell Isolation, Digestion, and Freezing

ابدأ بوضع الأجنة التي تم تشريحها من أنثى الفأر الحامل التي تم قتلها رحيما من شهرين إلى ستة أشهر في وسط بارد كامل مع مصل بقري جنيني بنسبة 1٪. بعد إزالة أنسجة بطانة الرحم والمشيمة وكيس الصفار من الجنين تحت تكبير 5X ، قم بتشريح أسلاف القلب من منطقة القلب الجنينية باستخدام ملقط. اسحب جميع مناطق القلب التي تم تشريحها من خمسة أجنة فئران في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر وطردها مركزيا في دلو متأرجح ، مبرد مسبقا إلى أربع درجات مئوية.

إزالة طاف ، وغسل الأنسجة مع ملليلتر واحد من PBS الصف زراعة الأنسجة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 300G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. ثم ، قم بإزالة المادة الطافية ، وكرر غسلتين مع ملليلتر واحد PBS.

بمجرد الانتهاء من ذلك ، استبدل PBS ب 0.05٪ Trypsin-EDTA. أجهزة الطرد المركزي وكرر غسلتين مع 0.05٪ Trypsin-EDTA. لهضم الأنسجة ، أضف 50 ميكرولترا من 0.05٪ Trypsin-EDTA وسخنها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتطبيق تفكك ميكانيكي لطيف بعد خمس دقائق عن طريق شفط التعليق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف مرشح واسع الفتحة. قم بتعطيل نشاط هضم التربسين عن طريق إضافة 350 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الخلايا المنفصلة. مرر تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.

قم بإعداد الخلايا للتجميد عن طريق الطرد المركزي لتعليق الخلية المنفصل حديثا. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط التجميد المبرد. انقل تعليق الخلية إلى قنينة تبريد مسبقة التبريد ، وضع قارورة التبريد في حاوية تجميد مبردة مسبقا.

ضع وعاء التجميد عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة أربع إلى ثماني ساعات قبل نقله إلى النيتروجين السائل لإجراء تجارب التسلسل.