قبل تلطيخ الفلورسنت المناعي المتعدد ، قم بإصلاح الأنسجة وإجراء إزالة البارافين وتثبيط البيروكسيديز الداخلي. ثم بالنسبة للتلطيخ المناعي متعدد الإرسال ، غمر الشرائح في جرة تلطيخ سعة 300 ملليلتر تحتوي على مخزن مؤقت سترات 10 مللي مولار مع 0.1٪ Triton X-100. ضع برطمان التلوين مع إغلاق الغطاء في الميكروويف لمدة ثلاث إلى خمس دقائق بأقصى طاقة حتى يبدأ المخزن المؤقت في الغليان.
بعد الغليان ، اترك المخزن المؤقت في درجة حرارة قريبة من الغليان عن طريق وضع الميكروويف على طاقة منخفضة لمدة 15 دقيقة. مرة أخرى ، قم بتسخين المخزن المؤقت عن طريق وضع الميكروويف بأقصى طاقة لمدة 90 ثانية. أخرج البرطمان من الميكروويف واترك المخزن المؤقت يبرد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
اشطف الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها بالماء المقطر ، تليها خمس دقائق من الشطف في محلول ملحي مخزن من Tris يحتوي على 0.1٪ Tween 20 أو TBS Tween. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة TBS Tween عن طريق تنشيف الشرائح على منشفة ورقية. بعد ذلك ، ضع الشرائح على صندوق شرائح المجهر وقم بتطويق الأنسجة بقلم كاره للماء.
سد مواقع الربط غير المحددة عن طريق تغطية الأنسجة ب 5٪ BSA مذاب في TBS Tween. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر عن طريق تنشيف الشرائح على منشفة ورقية. بعد ذلك ، احتضان الأنسجة لمدة 60 دقيقة مع 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1 ٪ BSA ، TBS Tween.
بعد الحضانة ، شطف الشرائح ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها باستخدام TBS Tween. بعد الغسيل ، احتضان الأنسجة لمدة 40 دقيقة مع 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية Poly-HRP. بعد الحضانة ، شطف الشرائح ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها باستخدام TBS Tween.
بعد ذلك ، احتضان الأنسجة لمدة 10 دقائق مع 300 ميكرولتر من كاشف التيراميد الفلوروكروم المخفف 200 أضعاف في العازلة بورات تستكمل بشكل ارتجالي مع 0.003 ٪ بيروكسيد الهيدروجين. ثم شطف الشرائح ثلاث مرات مع TBS توين واحتضان الأنسجة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع الجسم المضاد البشري عموم السيتوكيراتين المخفف في 1 ٪ BSA ، TBS Tween. في اليوم التالي ، شطف الأنسجة مع TBS توين واحتضان لمدة 120 دقيقة مع الجسم المضاد الثانوي مباشرة إلى جانب الفلوروكروم المخفف 200 أضعاف في 1 ٪ BSA ، TBS Tween.
بعد الحضانة ، شطف الأنسجة مع TBS توين قبل تلطيخ النوى مع bisBenzimide المخفف 1،000 أضعاف في 10 ٪ BSA ، TBS توين لمدة خمس دقائق. اشطف المنديل ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها في الماء المقطر قبل تركيبه على شريحة باستخدام وسيط تركيب مضان وزجاج غطاء البورسليكات. لتحليل الصور، قم باستيراد عمليات المسح الضوئي إلى برنامج تحليل الصور.
ثم انتقل إلى علامة التبويب التحليل وحدد خوارزمية التألق عالية الإرسال بالنقر فوق الإعدادات والإجراءات ثم تحميل. حدد علامة التبويب تحديد الصبغة والصبغة ذات الأهمية. في علامة التبويب الكشف النووي ، انتقل إلى نوع التجزئة النووية وحدد الذكاء الاصطناعي مخصص.
ثم في مصنف التجزئة النووية ، حدد المدرب المحفوظ AI.In علامة التبويب الكشف عن الغشاء والسيتوبلازم ، واختر الحد الأقصى لنصف قطر السيتوبلازم وعدد أصباغ الغشاء. لكل صبغة ، حدد عتبة النواة الموجبة ، والعتبة الإيجابية للسيتوبلازم ، والعتبة الإيجابية للغشاء. لكل صبغة ، حدد نسبة النواة والغشاء والسيتوبلازم من قيم الاكتمال.
احفظ الخوارزمية عن طريق تحديد الإعدادات والإجراءات والحفظ. قم بتحليل منطقة الاهتمام بالنقر فوق تحليل وتحديد طبقة التعليقات التوضيحية. ثم انتقل إلى علامة التبويب النتائج وحدد جميع البيانات في بيانات الكائن.
قم بتصدير البيانات بتنسيق CSV بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق تصدير وتحديد objectdata.csv. تظهر نتيجة تمثيلية للتلطيخ الأمثل عن طريق التألق المناعي المتعدد. كان اختيار التخفيف الصحيح ضروريا للتحقق من خصوصية الجسم المضاد وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء للتلطيخ.
