للبدء ، خذ شظايا الحمض النووي للخلية النادرة التي تم سحبها بالبيوتين. قم بإعداد مزيج رئيسي عن طريق إضافة الكواشف لمخلفات dATP واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتعطيل Klenow exo-ناقص عن طريق احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية وتبريدها على الجليد.
بعد غسل الخرز ب 300 ميكرولتر لكل من TB و NTB و 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط ، أعد تعليقها في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للربط. أضف أربعة ميكرولتر من مزيج محول 15 ميكرومولار الملدن مسبقا وميكرولتر واحد من 2000 وحدة لكل ميكرولتر T4 DNA ligase إلى العينة. اغسل الخرزات ب 400 ميكرولتر من السل ، و 200 ميكرولتر من NTB ، و 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتقييد اثنين.
بعد تضخيم المكتبة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتجميع جميع تفاعلات 50 ميكرولتر من نفس العينة في أنبوب ربط منخفض للحمض النووي 1.5 ملليلتر. ضعه على مغناطيس أنبوبي وانتظر حتى تعلق جميع الخرزات على الحائط. انقل المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة إلى أنبوب ربط منخفض للحمض النووي جديد سعة 1.5 ملليلتر وقم بتعبئته بمخزن مؤقت TLE إلى 500 ميكرولتر.
لإجراء اختيار على الوجهين باستخدام تنقية حبة بارامغناطيسية ، أضف 200 ميكرولتر من حبات المخزون إلى المكتبة ، واخلطها عن طريق الدوامة ، واحتضانها لمدة 10 دقائق ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع المكتبة على مغناطيس وانتظر حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط. انقل المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة إلى أنبوب ربط منخفض جديد للحمض النووي سعة 1.5 ملليلتر.
ركز الخرزات عن طريق أخذ 750 ميكرولتر من حبات المخزون ووضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر على مغناطيس. بمجرد أن تعلق جميع الخرز على الحائط ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخرز عن طريق دوامية 300 ميكرولتر من حبات المخزون الجديدة. أضف 300 ميكرولتر من الخرز المركز إلى العينة.
تخلط عن طريق دوامة واحتضان لمدة 10 دقائق ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة. ضع على المغناطيس. انتظر حتى تعلق جميع الخرزات على الحائط وقم بإزالة المادة الطافية.
اغسل الخرزات بإضافة ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى الأنبوب مع بقاء الخرزات على المغناطيس. اترك الخرزات تجف في الهواء وأعد تعليقها في 21 ميكرولترا من المخزن المؤقت TLE عن طريق الدوامة. لإزالة المكتبة من الخرز ، احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية.
ضع الأنبوب في مغناطيس وانقل المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط للحمض النووي سعة 1.5 ملليلتر.
