ابدأ بخلط 200 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة مع ميكروغرام من أي حمض نووي بلازميد واحد بشكل منفصل في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. كرر هذا مع اثنين من البلازميدات الأخرى في أنابيب منفصلة. ثم في الأنبوب الجديد الثاني ، امزج 200 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة مع ستة ميكرولترات من كاشف النقل واخلط المحتويات عن طريق الماصة.
احتضان الأنابيب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل خلط محتوى الأنبوب الثاني إلى الأنبوب الأول. في أنابيب منفصلة ، كرر خلط البلازميدات الأخرى مع كاشف النقل. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، من ناحية الإسقاط ، أضف مجمعات النقل إلى أطباق التصوير المصنفة بخلايا HeLa ، مما يضمن التوزيع المتساوي عبر الطبق بأكمله. قبل ساعة واحدة من التصوير ، افتح صمام خزان ثاني أكسيد الكربون وقم بتشغيل وحدة التحكم البيئية للمجهر. باستخدام السهمين لأعلى ولأسفل على لوحة اللمس ، اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون على 5٪ اضغط على ضبط عند الانتهاء.
لضبط إعدادات الليزر، قم بتشغيل ليزر الضوء الأبيض بالنقر فوق علامة التبويب اكتساب وتحديد فتح نظرة عامة على الليزر. في مربع الحوار، قم بتبديل ليزر الضوء الأبيض إلى تشغيل. أدخل طاقة الليزر بنسبة 85٪انقر فوق زر التحكم في الإثارة وحدد الطاقة القصوى من القائمة المنسدلة.
ابدأ بيركولات إيثيل إيثيل رودامين إيثيل استر أو TMRE ، جرب عن طريق ضبط ليزر الإثارة على 514 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 524 إلى 545 نانومتر ل YFP. بعد ذلك ، بالنسبة إلى MitoTracker Deep Red ، اضبط ليزر الإثارة على 641 ونافذة أطياف الانبعاث على 650 إلى 750 نانومتر. وبالمثل ، بالنسبة ل TMRE ، اضبط ليزر الإثارة على 555 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 557 إلى 643 نانومتر.
ابدأ إعداد الحصول على الصورة عن طريق تحديد علامة التبويب اكتساب وضبط التنسيق إلى 1024 × 1024. اضبط السرعة على 600 في القائمة المنسدلة. ثم انقر فوق الزر "متوسط الخط" ومن القائمة المنسدلة ، حدد ثلاثة.
قم بتشغيل المسح ثنائي الاتجاه واضبط عامل الطور والتكبير / التصغير على 22.61 و 1.50 على التوالي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، حدد الخلايا بناء على إشارة الفلورسنت YFP بالنقر فوق إعداد YFP والضغط على Fast Live. ثم اضبط كسب وشدة YFP ثم حدد الخلايا بناء على إشارة الفلورسنت YFP.
لتصوير لوحة التحكم DMSO في تجربة TMRE ، اضبط كسب وشدة إعداد إشارة TMRE اثنين بحيث تكون كثافة شبكة الميتوكوندريا أقل بقليل من التشبع. حافظ على الكسب والشدة ل TMRE ثابتة. ثم اضبط كسب وشدة إعداد MitoTracker بحيث تكون شبكة الميتوكوندريا مرئية ، ولكن خافتة.
بمجرد اكتمال إعدادات الكسب والشدة ، انقر فوق ابدأ للحصول على صورة. الحصول على صور من 20 خلية لكل حالة تجريبية.
