استخدم شمعة البيض لتتبع محيط الجيب الهوائي فوق الجنين E14 أو E15 بقلم رصاص وقم بتغطية المنطقة المحددة بشريط شفاف. باستخدام مقص منحني أو ناعم ، قم بقص المنطقة التي تم تتبعها برفق. احرص على عدم قطع غشاء الجنين أو الأوعية الدموية.
ثم تجاهل القطعة العلوية من القشرة. بعد قطع رأس جنين الفرخ ، ضع الرأس في طبق 10 سم بمحلول CMF بارد ومعقم. باستخدام ملقط دقيق معقم ، قشر الجلد الذي يغطي الدماغ للكشف عن الأم الجافية الأساسية.
إزالة عظام الجمجمة المشكلة على الجانبين الأيسر والأيمن من الدماغ. عظام الجمجمة المشكلة لا تغطي بعد غالبية الدماغ. استخدم ملقط مدبب ناعم برفق لتمزيق السحايا ، وتغطية مركز الدماغ وقشره إلى كل جانب للكشف عن الدماغ.
باستخدام ملقط منحني ناعم ، اغرف الدماغ لأعلى من أسفل الجبهة واسحبه برفق من تجويفه. تشريح الدماغ إلى أجزائه الرئيسية الثلاثة الدماغ الأمامي أو الدماغ المتوسط أو التكتا البصرية والمخيخ. قم بإزالة الأم التي تعلو الحنون من القفص باستخدام ملقط دقيق وضع مناطق الدماغ المشرحة في طبق معقم صغير على الثلج.
لتضمين الدماغ وتقطيعه ، التقط برفق إما القفص البصري أو منطقة الدماغ الأمامي باستخدام ملقط منحني كمغرفة وصمة عار قليلا على شاش معقم لإزالة السائل الزائد. قم بإعداد قالب بسيط عن طريق تشكيل رقائق الألومنيوم حول جسم مناسب الحجم. هنا ، يتم استخدام كتلة تقطيع الأنسجة المعدنية الصغيرة المستطيلة ككائن.
استخدم ماصة نقل معقمة واملأ القالب بأغاروز منخفض الذوبان. ضع منطقة الدماغ بسرعة في الأغاروز واتركها تتصلب لمدة أربع إلى خمس دقائق تقريبا على الجليد. قطع الأجزاء على قطاعة الأنسجة تهتز باستخدام سكين الياقوت.
استخدم الملعقة المعقمة لغرف وإزالة الشريحة من الدرج. حرك القسم برفق من الملعقة وعلى ملحق الغشاء باستخدام ملعقة معقمة أخرى. ضع الصفيحة الستة من شرائح الدماغ على حشوات الغشاء في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي للطلاء ، استخدم ماصة باستور معقمة لشفط الوسائط من أسفل الملحق وإضافة ملليلتر واحد من وسائط الشرائح الطازجة إلى كل بئر أسفل ملحق الغشاء. بعد ذلك ، لإدخال خلايا GBM على شرائح الدماغ ، قم بإزالة واحد إلى عدة كرويات من طبق الاستزراع باستخدام ماصة صغيرة سعة 20 ميكرولتر مضبوطة على خمسة ميكرولترات. اطرد الوسائط برفق باستخدام كرويات على شريحة الدماغ المرغوبة واسمح للكرويات بالزراعة على الشريحة لمدة يومين إلى خمسة أيام.
يتم عرض نتائج الجدوى لشرائح القفص البصري x vivo بعد أسبوع واحد في الاستزراع في هذا الشكل. تظهر الصور متحدة البؤر لشريحة دماغية ملطخة بالنوى مع ثنائي بنزيميد وملطخة بالمناعة للامينين بوضوح أوعية دموية طبيعية وسليمة مقسمة بصريا في تكوينات مختلفة. تظهر هنا صورة الإسقاط القصوى للكومة Z متحدة البؤر لشريحة الدماغ الملطخة بعامل النسخ SOX 2 والنوى الكلية مع ثنائي البنزيميد.
تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن زراعة شرائح دماغ جنين الفرخ على حشوات الغشاء لمدة أسبوعين تقريبا وتظل قابلة للحياة مع ظهور الأوعية الدموية الطبيعية وتعبير عامل النسخ.
