ابدأ بوضع فأر حامل تم التضحية به على ظهره على لوح تشريح. باستخدام ملقط ، قرصة خط الوسط البطن. مع زوج من المقص الحاد ، وقطع البطن من خلال الجلد والبريتوني من الأعضاء التناسلية إلى القفص الصدري على خط الوسط.
قم بإزالة الرحم الذي يحتوي على الأجنة وضعه على الفور على الجليد. قطع بعناية من خلال كيس صفار البيض على الجانبين المشيمة وإزالة الأجنة. ثم ضع الرؤوس الجنينية مقطوعة الرأس في طبق مثلج يحتوي على HBSS الذي يعاني من نقص الكالسيوم والمغنيسيوم.
ضع الرأس في طبق 35 ملم مواجه لليسار. بيرس عين واحدة مع حافة ملقط ، عقد بقوة الذقن مع الآخر. تمزيق جلد فروة الرأس برفق من القفا على طول خط الوسط باتجاه الخطم.
استخدم الملقط المائل للدخول من خلال الحبل الشوكي البيضاوي الأبيض وشق الجمجمة المفتوحة على طول خط الوسط ، مما يؤدي إلى كشف الدماغ. قشر الجمجمة برفق بعيدا عن الجانبين. ثم ارفع الدماغ من الجمجمة وتخلص من الجمجمة.
استخدم ملقط لإزالة السحايا. ضع الأدمغة في بيجو يحتوي على ملليلتر من الكالسيوم والمغنيسيوم HBSS الذي يعاني من نقص المغنيسيوم. أضف 250 ميكرولتر من 10X تربسين إلى بيجو.
سحن الأدمغة عن طريق هز بيجو ثم احتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من مثبطات التربسين فول الصويا إلى كل بيجو. رج العبوة لتفريق المانع بالتساوي.
بدون طرد مركزي ، انقل ملليلتر من المادة الطافية من كل بيجو إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. باستخدام إبرة قياس 19 متصلة بحقنة سعة خمسة ملليلتر ، قم بشفط المعلق مرتين لسحن الخلايا المتبقية في بيجو. كرر الشفط مرتين بإبرة قياس 21.
باستخدام إبرة 23-G ، انقل الخلايا من bijou إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 ملليلتر الذي يحتوي على طافي الخلية وأجهزة الطرد المركزي عند 200 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة مصلية خمسة ملليمترات ، انقل كل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر دون إزعاج الحبيبات. كرر الطرد المركزي.
أضف 10 ملليلتر من وسائط الطلاء إلى أنبوب يحتوي على الكريات المدمجة من كل من خطوات الطرد المركزي واخلطها جيدا لإنشاء تعليق كامل. تلطيخ الخلايا مع تريبان الأزرق والعد باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا. صفيحة الخلايا عن طريق إضافة الحجم المطلوب من تعليق خلايا الدماغ الجنينية الفئران E17 في لوحة جيدة.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 5 إلى 7٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. بعد إزالة الوسائط ، أضف وسائط تمايز جديدة لكل بئر. اضغط لأسفل على أي زلات غطاء عائمة باستخدام طرف ماصة معقم.
الحفاظ على الثقافات عن طريق إزالة جزء من المادة الطافية واستبدالها بوسائط تمايز جديدة ثلاث مرات كل أسبوع. تم تصور الثقافات من خلال تلطيخ التألق المناعي ل NG2 و nestin كعلامات تنموية ، SMI31 ، MBP ، و NeuN كعلامات عصبية ، و CNP و GFAP و Iba1 كعلامات دبقية أثرت إصابة الثقافات بفيروس غابة Semliki العصبي على الخلايا قليلة التغصن والخلايا العصبية. أظهرت فحوصات qRT-PCR للخلايا المصابة تنظيما للسيتوكين الكيميائي Ccl5 mRNA في المزارع المعالجة بالإنترفيرون بيتا.
أظهرت دراسات ELISA زيادة Ccl5 في المادة الطافية ، وبالتالي عرض علاقة بين mRNA وتعبير البروتين. أظهرت دراسات التدفق الخلوي للتعليق أحادي الخلية أن 70٪ من الخلايا ظلت قابلة للحياة. كان هناك عدد كبير من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والخلايا النجمية ، بينما كانت الخلايا قليلة التغصن هي الأقل وفرة.
