ابدأ باستنشاق الوسائط من الألواح التي تحتوي على خام ملتصق 264.7. أضف 10 ملليلتر من PBS لكل لوحة 15 سم. استخدم مكشطة خلوية لفصل الخلايا وسحبها إلى أنبوب واحد سعة 50 ملليلتر.
ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا لتجانس. بعد ذلك ، انقل 5٪ من حجم تعليق الخلية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي عند 300G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تخلص من المادة الطافية وضع حبيبات كسر الخلية الكلية على الثلج. بعد الطرد المركزي للتعليق المتبقي كما هو موضح سابقا ، قم باستنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من محلول الميتوكوندريا البارد الجليدي. أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 300G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
أعد تعليق الحبيبات في 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للميتوكوندريا الباردة. ونقل التعليق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتجانس التعليق ، وتجاوزه 30 مرة من خلال إبرة قياس 25 مثبتة على حقنة ملليلتر واحدة.
ثم أضف ملليلتر واحد من العازلة الميتوكوندريا الباردة إلى الأنبوب واخلطها عن طريق الانقلاب. بعد الطرد المركزي للخلايا ، انقل ملليلتر واحد من المادة الطافية إلى أنبوب جديد على الجليد. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت وقم بتجانس الحبيبات بالمرور عبر إبرة قياس 25 مثبتة على حقنة سعة ملليلتر واحد.
اسحب كريات الخلايا المتجانسة والمادة الطافية من الخطوات السابقة إلى أنبوب واحد سعة 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 2،000G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية وقسمها إلى أربعة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر.
قم بتكوين الحجم في كل أنبوب إلى 1.5 ملليلتر باستخدام العازلة للميتوكوندريا. اقلب الأنابيب لخلط محتوياتها ثم قم بطرد الأنابيب مركزيا. قم بإزالة المادة الطافية والحبيبات الخلوية البيضاء العلوية بعناية.
احتفظ بأحد الأنابيب الأربعة التي تحتوي على حبيبات الميتوكوندريا البنية على الجليد كجزء من الميتوكوندريا الخام. اسحب الكريات المتبقية إلى أنبوب جديد واجعل الحجم النهائي ملليلتر واحد مع عازلة الميتوكوندريا. باستخدام هذا البروتوكول ، تم الحصول على إجمالي الخلايا وكسور الميتوكوندريا الخام من خط خلايا البلاعم الخام 264.7 و BMDM.
أظهر تحليل الدم المناعي أن سينسيز سترات الميتوكوندريا تم تخصيبه في الجزء الخام. اختفت البروتينات من العصارة الخلوية وغشاء البلازما والنواة والليزوزوم والشبكة الإندوبلازمية. أظهر تحليل البروتين إثراء بأكثر من عشرة أضعاف في الجزء الخام.
تم استنفاد المقصورات الخلوية الست الأخرى أثناء التنقية.
