Mini-Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR

تلقيح L.reuteri في 10 ملليلتر من مرق MRS يحتوي على مضاد حيوي مناسب واحتضانه بين عشية وضحاها هوائيا عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، أجهزة الطرد المركزي الثقافة في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات في ملليلتر من جهاز الطرد المركزي العازل القياسي P1 مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت P1 المعدل. احتضان لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من المخزن المؤقت P2 واخلطه عن طريق قلب أربع إلى ست مرات. بعد خمس دقائق ، أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت N3 واخلطه عن طريق قلب الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 G لمدة 10 دقائق ونقل أكبر قدر ممكن من المواد الطافية إلى عمود الدوران.

أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 60 ثانية وتجاهل التدفق. اغسل عمود الدوران ب 500 ميكرولتر من PB العازلة وأجهزة الطرد المركزي ، وتجاهل التدفق. اغسل عمود الدوران ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت PE وأجهزة الطرد المركزي عند 10،000 جم لمدة 60 ثانية.

تخلص من التدفق وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 60 ثانية لإزالة أي مخزن مؤقت متبقي. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف 20 إلى 30 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج الخالي من Dnase و RNase إلى مرشح عمود الدوران واتركه لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل الطرد المركزي عند 10،000 جم لمدة 60 ثانية.

قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي باستخدام بادئات خاصة بالبلازميد مع الشطف الذي يوفر قالب الحمض النووي ، بما في ذلك التحكم الإيجابي باستخدام بلازميد مشتق من E.coli mini-prep. يؤدي تشغيل الشطف المصغر من خلال هلام الأغاروز إلى مسحة ، بدلا من العصابات التي يمكن ملاحظتها. ومع ذلك ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق باستخدام الشطف كقالب للحمض النووي ينتج أحجام النطاق المتوقعة.