ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System

للبدء ، ضع الفئران المخدرة على المنصة الجراحية. بعد قص الشعر ، ضعي مرهم العين على كلتا العينين لمنعهما من الجفاف. ثم إصلاح الفئران على جهاز stereotaxic للشلل.

قم بعمل شق صغير تحت المجهر لكشف الجمجمة بالكامل. قم بإعداد حقنتين سعة 10 ميكرولتر ، واحدة تحتوي على مستقبلات AAV2 / 5-adenosine 2A shRNA ، والأخرى تحتوي على تدافع AAV2 / 5. ثم استخدم المجهر لتحديد موقع bregma و lambda وتعيين نقطة الإحداثيات على حقنة 10 ميكرولتر بناء على أطلس الأطلس التجسيمي لدماغ الفأر.

حفر ثقب صغير في الجمجمة في نقطة الإحداثيات المحددة. حقن اثنين ميكرولتر من فيروس shRNA لمستقبلات AAV2 / 5-Adenosine 2A في بطين الدماغ عن طريق الحقن الجانبي بمعدل ثابت يبلغ 100 نانولتر في الدقيقة. احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 10 دقائق قبل الانسحاب.

أغلق الجلد المصاب على الفور باستخدام غراء الفيبرين الحيوي الطبي لمنع فقدان الفيروس. ضع الماوس على وسادة التدفئة ، مع الحفاظ على درجة حرارة جسمه عند 37 درجة مئوية تقريبا لتسهيل الشفاء. حقن ميكرولتر من CRE-TAT Recombinase في كل بطين جانبي لفأر الطماطم Arosa L-D-L-T-D للمجموعة التجريبية ، واثنين ميكرولتر من PBS المعقم للمجموعة الضابطة.

بعد أسبوعين من حقن CRE-TAT Recombinase ، قم بإعداد أقسام الأنسجة المجمدة ، وقم بإجراء تلطيخ نووي وإعداد الشريحة للتصوير أدى هدم مستقبلات الأدينوزين 2A في الضفيرة المشيمية في الفأر المتدفق لمستقبلات الأدينوزين 2A متماثل الزيجوت ، باستخدام CRE-TAT ، إلى انخفاض الدرجات السريرية EAE. وبالمثل ، فإن هدم الضفيرة المشيمية في الفئران البرية من النوع البري لمستقبلات الأدينوزين 2A ، باستخدام AAV2 / 5 shRNA قلل من الدرجات السريرية EAE. أظهر تحليل QPCR أن مستويات mRNA لمستقبلات الأدينوزين 2A انخفضت في مجموعات AAV2 / 5 shRNA و CRE-TAT ، مقارنة بكل عنصر تحكم.

إسكات مستقبلات الأدينوزين 2A ، وتحديدا في الضفيرة المشيمية ، قلل من تسلل الخلايا المناعية إلى الحبل الشوكي.