لطلاء اللوحة ب EME ، قم بتخفيف EME 1 إلى 20 في DMEM المتقدم البارد + للطلاء بالكولاجين ، قم بتخفيف خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من الكولاجين I في Advanced DMEM + إلى 100 ميكروغرام لكل ملليلتر. قم بتغطيتها بالطبق ب 200 ميكرولتر من EME المخفف أو الكولاجين لتغطية سطح البئر بالكامل واحتضانه لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية. لتوليد طبقة أحادية ، قم باستنشاق الوسائط من لوحة 35 ملم تحتوي على مواد عضوية.
أضف ملليلترا واحدا من PBS وقم بتعطيل EME في الآبار بطرف P1000 ، مع السحب لأعلى ولأسفل حوالي 20 مرة لتخفيف كل EME. نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. أضف ملليلتر واحد من PBS إلى اللوحة لجمع مواد عضوية إضافية ونقلها إلى نفس الأنبوب المخروطي.
قم بطرد العينة عند 350 جم لمدة دقيقتين وإزالة المادة الطافية ، بما في ذلك أي بقايا EME. ثم ، أضف ملليلتر واحد من محلول التربسين إلى الحبيبات العضوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات باستخدام طرف P1000 وإضافة ملليلتر من DMEM المتقدم + لتحييد التربسين.
أجهزة الطرد المركزي عند 350 G لمدة خمس دقائق واستنشاق supernant قبل تعليق الحبيبات في 4.8 ملليلتر من rIOM2D. قم بإزالة EME الزائد أو الكولاجين في Advanced DMEM + من الآبار. ثم أضف 200 ميكرولتر من المواد العضوية في rIOM2D و 10 ميكرومولار Y27632 إلى كل بئر مطلي مسبقا.
بعد 4 إلى 16 ساعة ، اجمع الوسائط وأجهزة الطرد المركزي عند 1،000 جرام لمدة دقيقة واحدة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر وتخلص من الحبيبات. اغسل كل بئر ب 300 ميكرولتر من PBS قبل إضافة 200 ميكرولتر من rIOM2D بالطرد المركزي إلى كل بئر.
قم بتغيير rIOM2D كل يومين إلى ثلاثة أيام ، مع تعليق استخدام Y27632.2D أحادي الطبقات المطلي على EME الذي تم إصلاحه بسهولة إلى كرويات صغيرة عند إضافة EME مرة أخرى إلى أعلى الخلايا. في المقابل ، كانت ركيزة الكولاجين I غير كافية لإصلاح هياكل 3D.
