للبدء ، خذ المزيج الرقمي المذاب ، أو ddPCR الرئيسي وأضف المجسات ، والتمهيدي الأمامي ، والتمهيدي العكسي إليه في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد المزيج الرئيسي لكل هدف تضخيم باتباع التركيب المقترح الموضح على الشاشة ، واضبط تركيزات البادئات والمجسات حسب الحاجة. دوامة الخليط جيدا ولفترة وجيزة الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي صغير.
أضف إنزيم التقييد واقلبه للخلط. بعد ذلك ، أضف 16.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المحضر إلى كل بئر من لوحة PCR وأغلق اللوحة بفيلم لاصق شفاف. باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف العينة كمخفف ، قم بإعداد مراقبة الجودة أو تخفيفات مراقبة الجودة كما هو موضح في هذا الجدول والذي يمثل التركيزات الموصى بها لدقة التحقق من الصحة والتشغيل الدقيق.
قم بتخفيف عينات الدموع باستخدام مخزن مؤقت لتخفيف العينة بنسبة 1 إلى 10 في أنابيب PCR سعة 0.2 ملليلتر وأغلق الأنابيب. سخني العينات في جهاز تدوير حراري عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل. قم بإزالة الفيلم اللاصق من لوحة ddPCR التي تحتوي على المزيج الرئيسي وأضف 5.5 ميكرولتر من تخفيف مراقبة الجودة إلى الآبار المناسبة للوحة 96 بئرا كما هو موضح في خريطة اللوحة.
ثم أضف 5.5 ميكرولتر من العينة إلى الآبار. أضف 5.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخفيف العينة إلى عنصر التحكم بدون قالب أو آبار NTC. قم بتخفيف التحكم في المخزن المؤقت 2x ddPCR بنسبة 1 إلى 2 باستخدام الماء الخالي من النيوكلياز وأضف 22 ميكرولترا من المخزن المؤقت إلى أي آبار فارغة في العمود.
أضف ختما قابلا للثقب إلى اللوحة وضع اللوحة في مانع تسرب الألواح. أغلق اللوحة لمدة 5 ثوان عند 180 درجة مئوية. دوامة اللوحة بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية على الأقل وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في لوحة الدوران.
على شاشة اللمس الخاصة بمولد القطيرات الآلي، حدد الأعمدة على خريطة اللوحة التي تحتوي على العينات. سيضيء سطح الجهاز للإشارة إلى المواد الاستهلاكية المطلوبة. قم بتحميل مولد القطيرات من الخلف إلى الأمام.
سيتغير الضوء الأصفر من الأصفر إلى الأخضر للإشارة إلى كفاية المواد الاستهلاكية. ضع كتلة باردة وحامل لوحة القطرات. تأكد من أن الكتلة زرقاء اللون بالكامل ولا يوجد لون وردي مرئي.
ضع لوحة DDPCR جديدة 96 لحام في الكتلة الباردة. ضع لوحة PCR المعدة في حامل لوحة العينة. أغلق غطاء الماكينة، واضغط على Start (ابدأ) لتوليد القطرات.
في غضون 30 دقيقة ، قم بإزالة اللوحة التي تحتوي على القطرات من الكتلة الباردة. أضف ختما قابلا للثقب إلى اللوحة وضع اللوحة في مانع تسرب الألواح. أغلقه لمدة خمس ثوان عند 180 درجة مئوية.
ثم ضع اللوحة في جهاز تدوير حراري متوافق وأدخل ظروف ركوب الدراجات الموضحة على الشاشة. قم بتحميل اللوحة في قارئ القطيرات لضمان بقاء زيت قارئ كاف ومساحة كافية في حاوية النفايات. أخيرا ، اضغط على زر القراءة في البرنامج لبدء قراءة القطرات.
تم حساب متوسط الفحص الداخلي لكل تركيز في كل اختبار وتم استخدامه لتقييم دقة ودقة الفحص. تم العثور على متوسط دقة بين المقايسة بنسبة 7.7٪ ومتوسط دقة مقايسة مطلقة بنسبة 4.2٪ عبر جميع مستويات مراقبة الجودة. كما تم حساب الدقة والدقة بين المقايسة باستخدام المتوسط بين المقايسة لكل مستوى من مستويات مراقبة الجودة داخل كل دفعة.
تم العثور على دقة بين المقايسة تتراوح من 4 إلى 8.5٪ ودقة مطلقة بين المقايسة تتراوح من واحد إلى 3.2٪. وبالمثل ، بالنسبة لعينة المسيل للدموع ، لوحظ متوسط دقة بين المقايسة بنسبة 3.7٪ عند مستوى الارتفاع المرتفع و 12.2٪ عند مستوى الارتفاع المنخفض ومتوسط الدقة المطلقة بين المقايسة بنسبة 11.3٪ عند المستوى العالي و 8.1٪ عند المستوى المنخفض. في حالة حساب الفحص البيني ، تم العثور على دقة 5.5٪ عند المستوى العالي و 7.1٪ عند المستوى المنخفض ودقة مطلقة تبلغ 11.3٪ عند المستوى العالي و 8.1٪ عند المستوى المنخفض.
