للبدء ، قم بإعداد الجهاز عن طريق تشغيل مقياس التنفس عالي الدقة وتوصيله ببرنامج قياس التنفس VatLab للحصول على البيانات وتحليلها. استبدل الإيثانول بنسبة 70٪ في غرفة الأوكسيجراف بالماء المقطر المزدوج. باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي ، حركه باستمرار عند 750 دورة في الدقيقة في الحجرة.
اتركه لمدة 10 دقائق ثم استنشق الماء. اغسل الغرفة ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج لمدة خمس دقائق لكل منهما. لمعايرة مستشعرات الأكسجين ، قم أولا بإزالة الماء المقطر المزدوج والماصة ملليلتر من وسط تحضير الخلية في الغرفة.
ضع السدادات تاركا فقاعة تبادل الهواء. لتسجيل قيم معايرة الأكسجين ، اضبط الإعدادات مثل كسب المستشعر وجهد الاستقطاب والفاصل الزمني لتسجيل البيانات. ثم قم بتسمية التجربة وأدخل الوسيط.
انقر فوق التخطيط وحدد 01 تجربة المعايرة GR3 Temp. حرك الوسط بقضيب التحريك عند 750 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية ، وراقب أداء غشاء المستشعر. مع الاستمرار في الضغط على زر الماوس الأيسر ومفتاح Shift ، اسحب الماوس لتحديد منطقة يكون فيها التغيير في تركيز الأكسجين مستقرا.
ثم انقر فوق oxygraph ثم معايرة O2. في معايرة الهواء ، قم بتغيير العلامة المحددة إلى المنطقة المحددة مسبقا. ثم انقر فوق معايرة ونسخ إلى الحافظة.
أوقف التسجيل واحفظه بالنقر فوق أوكسيجراف. متبوعا ب OK Control ثم الحفظ وقطع الاتصال. بعد ذلك ، لإجراء تقييم الجهاز التنفسي ، افتح الغرفة واستنشق الوسط بالداخل.
قم بتحميل خلايا الحيوانات المنوية في حجم نهائي يبلغ مليلتر من MRM لتحليل الخلايا النفاذية. قم بتحميل المعايرة بالنقر المزدوج على مربع معايرة نقاط البيع في الزاوية السفلية وفتح المعايرة التي تم إجراؤها مسبقا. ثم أوقف التجربة.
حقن 4.5 ميكرولتر من 10 ملليمولار ديجيتونين وتخلل الخلايا لمدة خمس دقائق. سجل تنفس الخلايا السليمة لمدة خمس دقائق على الأقل حتى يتم الحصول على إشارة مستقرة. ثم أضف الركائز للمجمع الأول أو المركب II.قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تزداد الإشارة وتستقر .
بعد ذلك ، قم بحقن خمسة ميكرولترات من 0.5 مولار ADP وقياس استهلاك الأكسجين حتى تزداد الإشارة وتستقر . أضف ميكرولتر واحد من أربعة ملليغرام لكل ملليلتر Oligomycin ، وهو مثبط ATP synthetase. قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تنخفض الإشارة وتستقر .
قم بالمعايرة بإضافة ميكرولتر واحد من FCCP في خطوات متتالية ، بدءا من 0.1 مليمولار إلى مليمول واحد حتى يتم الوصول إلى أقصى معدل تنفس غير مفصول. قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تزداد الإشارة وتستقر . توقف عن حقن الدواء عندما يبدأ استهلاك الأكسجين في الانخفاض.
أخيرا ، قم بحقن ميكرولتر واحد من المليمولار روتينون واحد للمركب الأول أو خمسة ملليمولار أنتيميسين أ للمجمع الثاني للتمييز بين استهلاك الميتوكوندريا والأكسجين المتبقي. قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تنخفض الإشارة وتستقر . لإجراء تحليل البيانات ، حدد المناطق التي يكون فيها تدفق الأكسجين لكل حجم مرتبط مستقرا بعد حقن الركيزة أو المانع ، وانقر فوق العلامات ، ثم نوافذ الإحصائيات ، وقم بتصدير البيانات.
تطبيع البيانات التي تم الحصول عليها لكل 1 مليون خلية منوية وطرح استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا من جميع القيم. احسب المؤشرات باستخدام هذه المعادلات. تم تحقيق تسجيل ناجح لخلايا الحيوانات المنوية السليمة من عينة السائل المنوي حيث أظهر الخط الأزرق تركيز الأكسجين ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين لكل حجم مرتبط.
أدى انخفاض عدد خلايا الحيوانات المنوية إلى انخفاض استهلاك الأكسجين الأساسي. علاوة على ذلك ، تم الحصول على منحنيات استهلاك الأكسجين خصيصا لمجمع الميتوكوندريا I أو المجمع II باستخدام هذا البروتوكول.
