للبدء ، اغسل الحويصلات الصغيرة المعزولة خارج الخلية أو SEVs مرتين عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 110،000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 70 دقيقة. أعد تعليق الحويصلات في 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS. ثم أضف خمسة ميكرولترات من مثبط الأنزيم البروتيني 100X إليها.
إخضاع العينة للتكسير بالموجات فوق الصوتية عند 40 واط لمدة 10 دقائق ، مع ثلاث ثوان من الوقت بالموجات فوق الصوتية ، وخمس ثوان من الوقت الفاصل. أجهزة الطرد المركزي الخليط المسحوق عند 13،700 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. إلى الطافية التي تم الحصول عليها ، أضف ديثيوثريتول إلى تركيز نهائي قدره 50 مللي مولار.
واحتضانها في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 50 ميكرولترا من اليودواسيتاميد المولي إلى المادة الطافية. واتركه يتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
الطرد المركزي الخليط في 13،700 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ونقل المادة الطافية التي تحتوي على مستخلص الببتيد الخام إلى أنبوب طرد مركزي فائق 10 كيلو دالتون. قم بإزالة البروتين من الببتيد الخام عن طريق الطرد المركزي لأنبوب الترشيح الفائق عند 13،700 جم وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
تجفيف النفايات السائلة المجمعة في مكثف طرد مركزي فراغ عند 45 درجة مئوية. لتحلية المياه ، استخدم الماء النقي من الدرجة الطيفية الكتلية كمذيب لجميع الكواشف. أولا ، قم بإذابة الببتيدات الجافة في 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلوروراستيك 0.1٪ أو TFA ، واتركها جانبا.
ثم أضف 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل النقي إلى كل عمود تحلية. أجهزة الطرد المركزي الأعمدة عند 400 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من النفايات السائلة. ثم أضف 100 ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل لكل عمود تحلية ، وكرر الطرد المركزي كما ذكرنا سابقا قبل التخلص من النفايات السائلة.
بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA إلى كل عمود تحلية قبل الطرد المركزي كما ذكرنا سابقا. مرة أخرى ، تخلص من النفايات السائلة. الآن ، قم بسحب الببتيدات الخالية من الملح في العمود المحلى.
أجهزة الطرد المركزي الأعمدة كما ذكر سابقا لتحميل العينة. أضف النفايات السائلة المستردة مرة أخرى إلى عمود التحلية لتكرار التحميل. ثم أضف 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA.
أجهزة الطرد المركزي كما ذكر سابقا ، والتخلص من النفايات السائلة. أخيرا ، أضف 50 ميكرولترا من 50٪ أسيتونيتريل تحتوي على 0.1٪ TFA إلى الببتيد في عمود التحلية. بعد التسريب المركزي ، كما ذكرنا سابقا ، قم بجمع النفايات السائلة في أنبوب طرد مركزي جديد لقياس الطيف الكتلي.
