للبدء ، قم برش الفأر الذكر C57 الأسود 6J البالغ من العمر 10 أسابيع جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الجلد من الطرف الخلفي وتشريح جميع عضلات الأطراف المحيطة بعظم الفخذ والساق والشظية. ضع عضلات الأطراف المحصودة في أنبوب سعة 2 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من محلول عزل العضلات.
وباستخدام المقص ، فرم العضلات المحصودة. انقل معلق العضلات المفروم إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر يحتوي على 18 ملليلتر من محلول عزل العضلات. أغلق الأنبوب بإحكام ، وأغلقه بغشاء مختبري ، وضعه أفقيا في حمام مائي يهتز.
بعد 30 دقيقة ، أضف خمسة ملليغرام من كولاجيناز النوع الأول وحافظ على الأنبوب لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد سحب تعليق العضلات لأعلى ولأسفل 10 مرات ، قم بطرد مركزي وتجاهل المادة الطافية ، تاركا خمسة ملليلتر من الوسط في الأنبوب. ماصة التعليق على مصافي الخلايا المتتالية وجمع التدفق من خلال أنبوب 50 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي التعليق وتجاهل الطافية حتى يبقى 100 إلى 200 ميكرولتر فقط في الأنبوب. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء واحتضانها على الثلج لمدة ثلاث دقائق. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وإزالة طاف من الأنبوب باستخدام ماصة 20 إلى 200 ميكرولتر.
أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد وضع الأنبوب على الثلج. بعد إزالة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية للتحكم السلبي ، قم بالطرد المركزي ال 90 ميكرولتر المتبقية وتخلص من المادة الطافية قبل احتضان الخلايا ب 400 ميكرولتر من بقعة الصلاحية القابلة للتثبيت المخففة في DMEM الخالي من المصل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS واقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وإضافة 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية في الأنبوب. بعد 30 دقيقة من الحضانة في الظلام ، أجهزة الطرد المركزي وتجاهل طاف. ثم أضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وإزالة المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. نقل التعليق إلى أنبوب خمسة ملليلتر. دوامة لفترة وجيزة تعليق الخلية قبل معالجتها على مقياس التدفق الخلوي.
اجمع الخلايا المحددة في الأنبوب المطلي بخمسة ملليلتر الذي يحتوي على مخزن FACS المؤقت. 75٪ من الخلايا أحادية النواة التي تم تحديدها بناء على حجمها وحبيبتها كانت سلبية لعلامة البقع القابلة للتثبيت مما أدى إلى متوسط 34.3٪ من الخلايا الحية. حوالي 3 ٪ من الخلايا الحية المفردة كانت سلبية للوحيدات ، البطانية ، الكريات البيض ، وعلامات محددة من الكريات الحمر.
ثم تم اختيار هذه الخلايا السالبة وفقا لتعبيرها عن علامات CD34 و ITGA7. تم إجراء بوابة أخيرة ل CXCR4 لاختيار خلايا الأقمار الصناعية المفترضة. ومن الخلايا الإيجابية ل CD34 ITGA7 ، تم العثور على 80٪ إيجابية ل CXCR4.
