أجهزة الطرد المركزي خلايا الأقمار الصناعية المعزولة FACS والتخلص من المادة الطافية. اغسل الخلايا بمليلتر واحد من PBS ، وأجهزة الطرد المركزي ، واحتضانها في ملليلتر واحد من محلول استخراج النووي البارد على الجليد لمدة 20 دقيقة. أضف 20 ميكرولترا من حبات Concanavalin A المغناطيسية المطلية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 850 ميكرولتر من محلول الربط على البارد.
ثم باستخدام رف مغناطيسي ، اغسل الخرزات مرتين بملليلتر واحد من المخزن المؤقت للربط البارد واترك الخرزات تتراكم على جانب الأنبوب على الرف لمدة خمس دقائق قبل تعليقها برفق في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط على البارد. بعد ذلك ، قم بطرد النوى وإعادة تعليقها برفق في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج النووي. ثم امزج 600 ميكرولتر من النوى المستخرجة مع 300 ميكرولتر من ملاط حبة Concanavalin A واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد إزالة المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي ، أعد تعليق النوى المرتبطة بالخرزة بملل لتر واحد من المخزن المؤقت للحجب البارد. مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية واغسل النوى المرتبطة بالخرز مرتين بملل لتر واحد من محلول الغسيل البارد. افصل المادة الطافية ، وأعد تعليق مجمعات حبة النواة برفق بجسم مضاد أولي محدد واحتضانها عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع تحريض لطيف.
في اليوم التالي ، قم بإزالة المادة الطافية واغسل النوى المرتبطة بالخرزة قبل تعليقها في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد. أضف 100 ميكرولتر من بروتين A-micrococcal nuclease المخفف إلى 100 ميكرولتر من النوى المرتبطة بالخرز واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة مع الإثارة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المادة الطافية واغسل النوى المرتبطة بالخرزة مرتين قبل تعليقها في 150 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.
بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 100 مليمولار ، واخلطها بسرعة عن طريق النقر والحضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة. أوقف التفاعل بإضافة 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي العينات ونقل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ، والتخلص من الحبيبات والخرز.
ثم أضف ثلاثة ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم و 2.5 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل ملليلتر بروتيناز K.Mix عن طريق الانقلاب واحتضان لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية. ثم أضف 300 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل والدوامة قبل النقل إلى أنبوبي قفل طور مليلتر. أجهزة الطرد المركزي وإضافة 300 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى نفس الأنبوب.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وجمع الطافية في أنبوب 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ميكرولترا واحدا من الجليكوجين ، ثم 750 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 100٪ ، واترك الحمض النووي يترسب طوال الليل عند 20 درجة سلزية تحت الصفر. في اليوم التالي ، قم بتجميع الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي ، ثم اغسل الحبيبات بمليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ وأجهزة الطرد المركزي مرتين قبل إزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة.
جفف الحبيبات في الهواء لمدة خمس دقائق وأعد تعليقها في 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت tris-EDTA. تم إثراء H3KME2 و H3K27AC حول TSS ل PAC7 و ITGA7 و LAM2 و CXCR4 و VCAM1. ومع ذلك ، لم يتم إثراء H3K4ME2 و H3K27AC في تلك الخاصة ب ITGAM أو PTPRC أو PECAM أو CKM أو MHY3.
لم يتم الحصول على أي إشارة تقريبا مع عينة IgG. يتم عرض تحليل عزر HOMER المعروف قمم AR وخلايا الأقمار الصناعية والمناطق المستهدفة في المئة. كشف تحليل Seeker النقاب عن ما يقرب من 500 قمة مع درجة ذروة أعلى من 50 مع أكثر من 200 منها بدرجة أعلى من 100.
