ابدأ بالطرد المركزي لمعلق الخلايا العصبية النقية عند 300 جم لمدة ثماني دقائق. قم بشفط المادة الطافية برفق وأعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولترا من HBSS بمحلول 0.5 BSA. بعد إضافة الجسم المضاد المحدد ، احتضان الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
اغسل الجسم المضاد الزائد بمحلول HBSS-BSA وأجهزة الطرد المركزي. أضف 20 ميكرولترا من ميكروبيدات المضادات الحيوية إلى الحبيبات ، المعاد تعليقها في HBSS-BSA. احتضان الأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم أضف 0.5 ملليلتر من HBSS مع محلول 0.5٪ BSA لكل 10 إلى الخلايا السبع. شطف العمود مع 0.5 ملليلتر من HBSS مع محلول 0.5 ٪ BSA. بمجرد توقف التنقيط ، ضع أنبوبا سعة 15 ملليلترا أسفل العمود ومرر 0.5 ملليلتر من معلق الخلية من خلاله.
اجمع الشطف الذي يحتوي على خلايا عصبية غير محددة ، ثم نظف العمود بثلاث غسلات من 0.5 ملليلتر من HBSS مع 0.5٪ BSA. الآن قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه في أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر. أضف ملليلتر واحد من HBSS مع 0.5٪ BSA واستخدم المكبس لطرد الخلايا المستهدفة.
بعد الطرد المركزي والطموح الطافي ، أعد تعليق الحبيبات في 0.5 ملليلتر من وسط الطلاء. عد الخلايا في غرفة عد نيوباور تحت مجهر المجال الساطع. لوحة الخلايا المستهدفة كعنصر تحكم إيجابي والخلايا غير المحددة كعنصر تحكم سلبي في لوحة 24 بئر المعدة.
احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بدأت الخلايا العصبية الإيجابية LepR في تكوين الخلايا العصبية بعد 48 ساعة. في DIV4 ، أظهرت الامتدادات المحورية تقدما ، بينما بدأت العمليات التغصنية في الظهور.
في DIV6 ، تم تطوير الخلايا العصبية بشكل كاف. أظهرت الدراسات المناعية أنه لم يلاحظ أي خلايا دبقية أو خلايا غير عصبية أخرى. تم تأكيد الطبيعة العصبية للخلايا من خلال تلطيخ البروتين 2 المرتبط بالأنابيب الدقيقة.
في DIV10 ، أعربت 30٪ من الخلايا الإيجابية ل LepR عن POMC. لوحظ الاتصال والوظائف المتشابكة في الثقافات العامة التي تحتوي على مجموعات عصبية غير متجانسة.
