للبدء ، خذ حويصلات الخميرة الفرعية للميتوكوندريا المحضرة وأجهزة الطرد المركزي الحويصلات المتولدة والميتوكوندريا المتبقية سليمة عند 20،000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. شكلت الميتوكوندريا السليمة الحبيبات بينما تبقى الحويصلات في المادة الطافية. بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي فائقة جديدة.
قم بتحميل وسادة من 0.3 ملليلتر من محلول السكروز 2.5 المولي في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام حقنة واحدة ملليلتر مجهزة بقنية ، وأجهزة طرد مركزي عند 118،000 غرام لمدة 100 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، ستظهر الحويصلات كقرص في الجزء العلوي من وسادة السكروز. تخلص من حوالي 90٪ من المادة الطافية.
لحصاد الحويصلات المركزة ، أعد تعليقها في المخزن المؤقت المتبقي ، بما في ذلك السكروز المولي 2.5 عن طريق الماصة. انقل التعليق إلى خالط Dounce بارد مثلج وقم بتجانس التعليق باستخدام خزاف بولي تترافلورو إيثيلين مع 10 ضربات على الأقل. بعد ذلك ، قم بإعداد تدرج خطوة 11 ملليلتر مع كل طبقة تحتوي على 2.2 ملليلتر من محلول السكروز.
احسب تركيز السكروز باستخدام هذه الصيغة. أضف أعلى تركيز للسكروز إلى أنبوب الطرد المركزي وضعه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم تجميد الطبقة تماما. قم بقياس تركيز السكروز للعينات باستخدام مقياس الانكسار.
إذا كان مقياس معامل الانكسار غير متوفر، افترض أن تركيز السكروز يساوي 2 مولار. لضبط تركيز السكروز إلى 0.6 ضرس ، أضف المماسح المناسبة ، E-D-T-A ، P-M-S-F ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني عند درجة الحموضة 7.4. قم بتحميل العينات بعناية على تدرج السكروز لتجنب اضطراب التدرج.
أجهزة الطرد المركزي الحويصلات في 200،000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة. إذا أمكن ، اضبط التسارع والتباطؤ البطيء لتجنب تعطيل التدرج. ثم حصاد التدرج من أعلى إلى أسفل في 700 ميكرولتر الكسور ، باستخدام ماصة ملليلتر واحد.
ينتج عنه 17 كسرا ، مما يوفر دقة كافية. بعد ذلك ، قم بإجراء ترسبين لحمض ثلاثي كلورو الخليك يتم تنفيذهما بالتتابع عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو الخليك بنسبة 72٪ إلى الكسور الفردية والخلط حتى يصبح المحلول متجانسا. احتضان الكسور لمدة 30 دقيقة على الجليد وحبيبات البروتينات المترسبة عن طريق الطرد المركزي عند 20،000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
تخلص من المادة الطافية. أضف 500 ميكرولتر من محلول حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 28٪. تخلط جيدا وكرر خطوة الطرد المركزي.
أخيرا ، قم بتحليل الكسور بواسطة SDS-PAGE و immunoblotting. يتم تقديم أهمية صوتنة خفيفة هنا. تم إثراء علامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا Tom40 في الكسور المبكرة منخفضة الكثافة وكانت غائبة تقريبا في الأجزاء اللاحقة.
تركزت علامة الغشاء الداخلي للميتوكوندريا Tim17 في كسور عالية الكثافة. في المقابل ، تراكم بروتين موقع التلامس Mic60 مخالفات لتركيز السكروز الوسيط ، مما يشير إلى التوليد الناجح والفصل اللاحق للحويصلات الغشائية المختلفة. في المقابل ، مع ظروف صوتنة أكثر قسوة ، يمكن اكتشاف علامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا Tom40 في أجزاء أقل من التدرج.
بالإضافة إلى ذلك ، كان هناك قدر كبير من مخالفات Tim17 ذات الكثافة المتوسطة.
