تعترف M.E.H. بالدعم المالي للمؤسسة الألمانية (DFG) ، المشروع رقم 413985647. يشكر المؤلفون الدكتور مايكل كيبلر ، جامعة لودفيغ ماكسيميليان ، ميونيخ ، على دعمه السخي والواسع. نحن ممتنون لوالتر نيوبرت على مدخلاته العلمية ومناقشاته المفيدة وإلهامه المستمر. JF يشكر كلية الدراسات العليا لعلوم الحياة في ميونيخ (LSM) على الدعم.

1. المخازن المؤقتة وحلول المخزون
<ol><li>اصنع محلول 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 7.4. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.</li>
	<li>تحضير 500 mM حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 8.0. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تحضير 2.4 متر السوربيتول في الماء منزوع الأيونات. تخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم.</li>
	<li>تحضير 2.5 متر السكروز في الماء منزوع الأيونات. تخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم.</li>
	<li>تحضير 200 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) في الأيزوبروبانول. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. تنبيه: PMSF سام إذا تم ابتلاعه ويسبب حروقا شديدة في الجلد وتلفا في العين. لا تتنفس الغبار ، وارتداء القفازات والنظارات الواقية.</li>
	<li>تحضير 72٪ حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) في الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. تنبيه: قد يسبب TCA تهيج الجهاز التنفسي وحروق الجلد الشديدة وتلف العين. لا تتنفس الغبار ، وارتداء القفازات والنظارات الواقية.</li>
	<li>تحضير المخزن المؤقت SM: 20 mM MOPS و 0.6 M السوربيتول ، درجة الحموضة 7.4.</li>
	<li>تحضير المخزن المؤقت للتورم: 20 مللي متر MOPS ، 0.5 mM EDTA ، 1 mM PMSF ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، درجة الحموضة 7.4.</li>
	<li>تحضير مخازن تدرج السكروز: 0.8 م ، 0.96 م ، 1.02 م ، 1.13 م ، و 1.3 م سكروز في 20 مللي مول مماسح ، و 0.5 مللي مول EDTA ، درجة الحموضة 7.4. ملاحظة: يمكن تخزين جميع المخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية ؛ ومع ذلك ، يوصى بتخزين المخازن المؤقتة المحتوية على السكروز عند -20 درجة مئوية لتجنب نمو الفطريات. يجب إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني طازجة قبل الاستخدام.</li>
</ol>2. توليد الحويصلات تحت الميتوكوندريا
<ol><li>عزل الميتوكوندريا الخميرة الخام طازجة وفقا للبروتوكولات المعمول بها34,35. ملاحظة: في هذه التجربة ، تم عزل الميتوكوندريا من Saccharomyces cerevisiae. توليد الميتوكوندريا النقية المتدرجة الخالية من العضيات الأخرى ليست ضرورية.</li>
	<li>أعد تعليق 10 ملغ من الميتوكوندريا المعزولة حديثا في مخزن مؤقت 1.6 مل SM (4 درجات مئوية) عن طريق السحب (الشكل 2 ، الخطوة 1).</li>
	<li>انقل معلق الميتوكوندريا إلى دورق Erlenmeyer المبرد مسبقا سعة 100 مل.</li>
	<li>أضف ببطء 16 مل من المخزن المؤقت للتورم باستخدام ماصة زجاجية سعة 20 مل. ضع تقليبا خفيفا ثابتا على الثلج أثناء الإضافة. ينتج عن هذه المعالجة التناضحية امتصاص الماء في مساحة المصفوفة. سيؤدي تورم الغشاء الداخلي للميتوكوندريا إلى تعطيل الغشاء الخارجي. ومع ذلك ، سيبقى كلا الغشاءين على اتصال في مواقع الاتصال9 (الشكل 2 ، الخطوة 2).</li>
	<li>احتضان العينات تحت التحريك الخفيف المستمر لمدة 30 دقيقة على الثلج.</li>
	<li>أضف ببطء 5 مل من محلول السكروز 2.5 M باستخدام ماصة زجاجية 5 مل لزيادة تركيز السكروز في العينات إلى 0.55 M تقريبا. ينتج عن هذه المعالجة التناضحية تدفق المياه من المصفوفة36. يهدف انكماش الغشاء الداخلي إلى زيادة المسافة إلى الأجزاء المتبقية من الغشاء الخارجي. هذا يقلل من احتمال توليد حويصلات هجينة اصطناعية من الأغشية الداخلية والخارجية من خلال صوتنة (الشكل 2 ، الخطوة 3).</li>
	<li>احتضان العينات تحت التحريك الخفيف لمدة 15 دقيقة على الثلج.</li>
	<li>إخضاع الميتوكوندريا للصوتنة لتوليد حويصلات غشاء تحت الميتوكوندريا (الشكل 2 ، الخطوة 4).<ol><li>انقل تعليق الميتوكوندريا إلى خلية وردة مبردة مسبقا.</li>
		<li>قم بتنشيط تعليق الميتوكوندريا بسعة 10٪ لمدة 30 ثانية أثناء تبريد خلية الوردة في حمام جليدي.</li>
		<li>ضع التعليق لمدة 30 ثانية في حمام جليدي.</li>
		<li>كرر الخطوة 2.8.2 والخطوة 2.8.3 ثلاث مرات أخرى. ملاحظة: ستختلف شروط الصوتنة وفقا للصوتنة المستخدمة. سيكون التحسين ضروريا للأجهزة الفردية. سيؤدي Sonication القاسي للغاية إلى تكوين حويصلات اصطناعية تتكون من أغشية داخلية وخارجية للميتوكوندريا.</li>
	</ol></li>
</ol>3. فصل الحويصلات تحت الميتوكوندريا
<ol><li>افصل الحويصلات المتولدة عن الميتوكوندريا السليمة المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سوف الميتوكوندريا السليمة بيليت بينما ستبقى الحويصلات في المادة الطافية.</li>
	<li>تركيز خليط الحويصلة.<ol><li>نقل طاف إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة.</li>
		<li>قم بتحميل وسادة سعة 0.3 مل من محلول السكروز 2.5 متر في قاع الأنبوب باستخدام حقنة سعة 1 مل مزودة بقنية 0.8 مم × 120 مم.</li>
		<li>أجهزة الطرد المركزي عند 118000 × جم لمدة 100 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بنصف قطر أقصى يبلغ 153.1 مم. تعتمد ظروف الطرد المركزي بشدة على الدوار وسيتعين تكييفها عند استخدام دوار آخر.</li>
	</ol></li>
	<li>ستظهر الحويصلات كقرص في الجزء العلوي من وسادة السكروز بعد الطرد المركزي. تخلص من حوالي 90٪ من المادة الطافية. الآن ، احصد الحويصلات المركزة عن طريق تعليقها في المخزن المؤقت المتبقي بما في ذلك السكروز 2.5 متر عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. انقل التعليق إلى خالط Dounce المثلج.</li>
	<li>تجانس التعليق مع ما لا يقل عن 10 ضربات باستخدام الخزاف polytetrafluoroethylene.</li>
	<li>تحضير التدرج السكروز.<ol><li>بالنسبة لتدرج خطوة 11 مل مع خمس خطوات (1.3 م ، 1.13 م ، 1.02 م ، 0.96 م ، و 0.8 م سكروز في 20 مللي مول ممسحة و 0.5 مللي مول EDTA ، درجة حموضة 7.4) ، تحتوي كل طبقة على 2.2 مل من محلول السكروز. ملاحظة: يوصى باستخدام مقياس إنكسار لقياس وضبط تركيزات السكروز. ومع ذلك ، فإنه ليس ضروريا. ضع 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت على مقياس الانكسار ، واكتشف مؤشرات الانكسار ذات الصلة. حساب تركيز السكروز على النحو التالي: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> 1.3333 يمثل معامل الانكسار للماء. 0.048403 هو مؤشر تحويل خاص بالسكروز تم الحصول عليه من القياس الخطي للانكسار المولي إلى تركيز السكروز في المحاليل المائية 37.</li>
		<li>أضف أعلى تركيز للسكروز إلى أنبوب الطرد المركزي ، وضع الأنبوب عند -20 درجة مئوية. انتظر حتى يتم تجميد الطبقة تماما قبل تطبيق الطبقة التالية. استمر وفقا لذلك حتى تتم إضافة الطبقة الأخيرة ، وقم بتخزين التدرجات عند -20 درجة مئوية. ملاحظة: تذكر نقل التدرجات المجمدة إلى 4 درجات مئوية عند بدء التجربة للسماح بالتدرجات بالذوبان. سيستغرق هذا حوالي 3 ساعات. بالنسبة للطرد المركزي هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بسعة 13.2 مل. عند استخدام دوار مختلف ، يجب تكييف أحجام خطوة التدرج وفقا لذلك.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بقياس تركيز السكروز للعينات باستخدام مقياس الانكسار. إذا لم يكن هناك وصول إلى مقياس الانكسار ، فيمكن للمرء أن يفترض بدلا من ذلك أن تركيز السكروز هو 2 M. سيكون تركيز السكروز المفترض هذا هو الأساس للخطوة التالية.</li>
	<li>اضبط تركيز السكروز على 0.6 متر عن طريق إضافة كمية مناسبة من 20 مللي مول MOPS ، 0.5 mM EDTA ، 1 mM PMSF ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، درجة الحموضة 7.4. إذا تم تقدير تركيز السكروز ب 2 متر بدلا من قياسه ، فمن المستحسن اختبار ما إذا كان التركيز منخفضا بدرجة كافية بعد التعديل. ضع حصة صغيرة من العينة (حوالي 50 ميكرولتر) فوق 200 ميكرولتر من السكروز 0.8 M في أنبوب اختبار. يجب أن تظل العينة فوق السكروز 0.8 M.</li>
	<li>قم بتحميل العينات (حوالي 1 مل) أعلى تدرج السكروز (احتفظ بنسبة 10٪ للرجوع إليها لاحقا). يعد السحب الدقيق أمرا مهما لتجنب اضطراب التدرج (الشكل 2 ، الخطوة 5).</li>
	<li>افصل الحويصلات عن طريق الطرد المركزي عند 200000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة. إذا أمكن ، اضبط جهاز الطرد المركزي على إبطاء التسارع والتباطؤ لتجنب اضطراب التدرج (الشكل 2 ، الخطوة 6). ملاحظة: هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بنصف قطر أقصى يبلغ 153.1 مم. تعتمد ظروف الطرد المركزي بشدة على الدوار وسيتعين تكييفها عند استخدام دوار آخر.</li>
	<li>احصد التدرج من أعلى إلى أسفل في أجزاء 700 ميكرولتر باستخدام ماصة 1 مل. سيؤدي ذلك إلى 17 كسرا ، مما يسمح بدقة كافية.</li>
</ol>4. تحليل الحويصلات تحت الميتوكوندريا
<ol><li>تركيز البروتينات عن طريق إخضاع كل جزء لاثنين من ترسبات TCA التي يتم إجراؤها بالتتابع38 لإعداد عينات SDS-PAGE.<ol><li>أضف 200 ميكرولتر من 72٪ TCA إلى الكسور الفردية ، واخلطها حتى يصبح المحلول متجانسا. احتضان الكسور لمدة 30 دقيقة على الجليد ، وحبيبات البروتينات المترسبة عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول TCA بنسبة 28٪ ، واخلطها جيدا ، وكرر خطوة الطرد المركزي.</li>
		<li>اغسل الكريات ب 1 مل من الأسيتون (-20 درجة مئوية) ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية, واترك الكريات تجف في الهواء. أعد تعليق الكريات في 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS ، واحتضان العينات لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. ملاحظة: ستبقى كمية كبيرة من السكروز ، خاصة في الأجزاء عالية الكثافة ، بعد هطول الأمطار TCA الأول. ستتم إزالة هذا من خلال هطول الأمطار TCA الإضافي.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتحليل 20 ميكرولتر من كل كسر بواسطة SDS-PAGE39 وimmunoblotting 40،41،42،43.</li>
</ol>

عزل مواقع الاتصال بالميتوكوندريا

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

تجزئة الميتوكوندريا هي تجربة معقدة مع عدة خطوات معقدة للغاية. لذلك ، كنا نهدف إلى زيادة تحسين ، وإلى حد ما ، تبسيط طريقتنا32 المعمول بها. هنا ، كانت التحديات هي الحاجة إلى معدات معقدة ومتخصصة للغاية ، والتي غالبا ما تكون إنشاءات فردية ، والوقت الهائل واستهلاك الطاقة. تحقيقا لهذ?...

تؤدي الميتوكوندريا مجموعة متنوعة من الوظائف المختلفة في حقيقيات النوى، وأكثرها شهرة إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفسفرة التأكسدية. تشمل الوظائف الأخرى إنتاج مجموعات الحديد والكبريت ، وتخليق الدهون ، وفي حقيقيات النوى العليا ، وإشارات Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج1،2،3،4. ترتبط هذه الوظائف ارتباطا لا ينفصم ببنيتها الفائقة المعقدة.
تم وصف البنية الفوقية للميتوكوندريا لأول مرة بواسطة المجهر الإلكتروني5. وقد تبين أن الميتوكوندريا هي عضيات معقدة إلى حد ما تتكون من غشاءين: الغشاء الخارجي للميتوكوندريا والغشاء الداخلي للميتوكوندريا. وبالتالي ، يتم تشكيل مقصورتين مائيتين بواسطة هذه الأغشية: الفضاء بين الغشاء والمصفوفة. يمكن تقسيم الغشاء الداخلي للميتوكوندريا إلى أقسام مختلفة. يبقى الغشاء الحدودي الداخلي على مقربة من الغشاء الخارجي ، ويشكل cristae غزوات. ما يسمى تقاطعات crista تربط الغشاء الحدودي الداخلي و cristae (الشكل 1). علاوة على ذلك ، تكشف الصور المجهرية الإلكترونية للميتوكوندريا المنكمشة تناضحيا عن وجود مواقع ترتبط فيها أغشية الميتوكوندريا بإحكام 6,7. تتشكل مواقع الاتصال المزعومة هذه بواسطة مجمعات بروتينية تمتد على الغشاءين (الشكل 1). يعتقد أن مواقع التفاعل هذه ضرورية لصلاحية الخلية نظرا لأهميتها لتنظيم ديناميكيات الميتوكوندريا والوراثة ، وكذلك نقل المستقلبات والإشارات بين السيتوسول والمصفوفة8.
من المحتمل أن يكون مجمع MICOS في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا هو أفضل مركب مميز وأكثر تنوعا لتشكيل موقع الاتصال. تم وصف MICOS في الخميرة في عام 2011 ، ويتكون من ست وحدات فرعية9،10،1 1: Mic60 و Mic27 و Mic26 و Mic19 و Mic12 و Mic10. هذه تشكل مجمعا من حوالي 1.5 MDa الذي يتمركز إلى تقاطعات crista9،10،11. يؤدي حذف أي من الوحدات الفرعية الأساسية ، Mic10 أو Mic60 ، إلى عدم وجود هذا المجمع 9,11 ، مما يعني أن هاتين الوحدتين الفرعيتين ضروريتان لاستقرار MICOS. ومن المثير للاهتمام ، أن MICOS لا يشكل موقعا واحدا فحسب ، بل مواقع اتصال متعددة مع بروتينات ومجمعات غشاء خارجي مختلفة من الميتوكوندريا: مجمع TOM 11,12 ، مركب TOB / SAM 9,12,13,14,15,16 ، مجمع Fzo1-Ugo1 9 ، Por1 10 ، OM45 10 ، و Miro 17. يشير هذا بقوة إلى أن مجمع MICOS يشارك في عمليات الميتوكوندريا المختلفة ، مثل استيراد البروتين ، واستقلاب الفوسفوليبيد ، وتوليد البنية الفوقية للميتوكوندريا18. من المحتمل أن تكون الوظيفة الأخيرة هي الوظيفة الرئيسية ل MICOS ، حيث أن غياب مركب MICOS الناجم عن حذف MIC10 أو MIC60 يؤدي إلى بنية فائقة غير طبيعية للميتوكوندريا تفتقر تماما إلى cristae منتظم. بدلا من ذلك ، تتراكم حويصلات الغشاء الداخلي دون اتصال بغشاء الحدود الداخلية19 ، 20. الأهم من ذلك ، يتم الحفاظ على MICOS في الشكل والوظيفة من الخميرة إلىالإنسان 21. يؤكد ارتباط الطفرات في الوحدات الفرعية MICOS بالأمراض البشرية الشديدة أيضا على أهميتها لحقيقيات النوى الأعلى22,23. على الرغم من أن MICOS متعدد الاستخدامات للغاية ، يجب أن توجد مواقع اتصال إضافية (بناء على ملاحظاتنا غير المنشورة). في الواقع ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال الأخرى ، على سبيل المثال ، آلات اندماج الميتوكوندريا Mgm1-Ugo1 / Fzo124،25،26 أو Mdm31-Por1 ، والتي تشارك في التخليق الحيوي للفوسفوليبيد الكارديوليبين27 الخاص بالميتوكوندريا. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين الطريقة التي قادتنا إلى تحديد MICOS لتحديد Cqd1 كجزء من موقع اتصال جديد تم تشكيله مع مجمع الغشاء الخارجي Por1-Om1428. ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن موقع الاتصال هذا يشارك أيضا في عمليات متعددة مثل توازن غشاء الميتوكوندريا ، واستقلاب الفوسفوليبيد ، وتوزيع الإنزيم المساعد Q28,29.
هنا ، استخدمنا اختلافا في التجزئة الموصوفة سابقا للميتوكوندريا9،30،31،32،33. تؤدي المعالجة الاسموزية للميتوكوندريا إلى تعطيل الغشاء الخارجي للميتوكوندريا وانكماش مساحة المصفوفة ، تاركة الغشاءين على مقربة فقط في مواقع الاتصال. وهذا يسمح لتوليد الحويصلات التي تتكون حصرا من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا أو الغشاء الداخلي الميتوكوندريا أو في تحتوي على مواقع الاتصال من كلا الغشاء من خلال صوتنة خفيفة. نظرا لأن الغشاء الداخلي للميتوكوندريا يحتوي على نسبة بروتين إلى دهون أعلى بكثير ، فإن حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا تظهر كثافة أعلى مقارنة بحويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. يمكن استخدام الفرق في الكثافة لفصل الحويصلات الغشائية من خلال الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز الطافية. وهكذا ، تتراكم حويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا بتركيزات منخفضة من السكروز ، بينما يتم إثراء حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا بتركيزات عالية من السكروز. تتركز الحويصلات التي تحتوي على مواقع التلامس بتركيزات السكروز المتوسطة (الشكل 2). يصف البروتوكول التالي هذه الطريقة المحسنة ، والتي تتطلب معدات ووقتا وطاقة أقل تخصصا مقارنة ببروتوكولنا الذي أنشأناهسابقا 32 ، بالتفصيل ويوفر أداة مفيدة لتحديد بروتينات موقع الاتصال المحتملة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbe refractometer</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipet Controller</td>
			<td>Brandtech, USA</td>
			<td>BR26320</td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1000 mL</td>
			<td>DWK Life Science, Germany</td>
			<td>C118.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson&#160; Digital Sonifier W-250 D</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>FIS15-338-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>101-148-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>15-338-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>B37912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>8043-30-0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbit</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>6213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>X747.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bath</td>
			<td>neoLab, Germany</td>
			<td>&#160;S12651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RCT basic</td>
			<td>IKA-Werke GmbH, Germany</td>
			<td>Z645060GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td>
			<td>Gerbu, Germany</td>
			<td>1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P1000</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P20</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P200</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix 1 mL</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495251879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>32395.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495052414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirring bar, 15 mm</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>442-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>33731</td>
			<td>discontinued, 
			any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method to isolate mitochondrial contact sites

توجد الميتوكوندريا في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا وتؤدي وظائف أساسية تتجاوز إنتاج الطاقة ، على سبيل المثال ، تخليق مجموعات الحديد والكبريت أو الدهون أو البروتينات ، والتخزين المؤقت Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج. وبالمثل ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى أمراض بشرية حادة مثل السرطان والسكري والتنكس العصبي. من أجل أداء هذه الوظائف ، يجب على الميتوكوندريا التواصل مع بقية الخلية عبر غلافها ، والذي يتكون من غشاءين. لذلك ، يجب أن يتفاعل هذان الغشاءان باستمرار. مواقع الاتصال البروتينية بين الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا ضرورية في هذا الصدد. حتى الآن ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال. في الطريقة الموضحة هنا ، تستخدم Saccharomyces cerevisiae mitochondria لعزل مواقع الاتصال ، وبالتالي تحديد المرشحين المؤهلين للحصول على بروتينات موقع الاتصال. استخدمنا هذه الطريقة لتحديد موقع ملامسة الميتوكوندريا ومجمع نظام تنظيم cristae (MICOS) ، وهو أحد مجمعات تكوين موقع التلامس الرئيسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم حفظه من الخميرة إلى البشر. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين هذه الطريقة لتحديد موقع اتصال جديد يتكون من Cqd1 ومجمع Por1-Om14.

Mitochondria perform a variety of different functions in eukaryotes, with the most well-known being the production of ATP through oxidative phosphorylation. Other functions include the production of iron-sulfur clusters, lipid synthesis, and in higher eukaryotes, Ca2+ signaling, and the induction of apoptosis1,2,3,4. These functions are inseparably linked to their complex ultrastructure.
The mitochondrial ultrastructure was first described by electron microscopy5. It was shown that mitochondria are rather complex organelles consisting of two membranes: the mitochondrial outer membrane and the mitochondrial inner membrane. Thus, two aqueous compartments are formed by these membranes: the intermembrane space and the matrix. The mitochondrial inner membrane can be even further divided into different sections. The inner boundary membrane stays in close proximity to the outer membrane, and the cristae form invaginations. So-called crista junctions connect the inner boundary membrane and the cristae (Figure 1). Furthermore, electron micrographs of osmotically shrunken mitochondria reveal that sites exist at which the mitochondrial membranes are tightly connected6,7. These so-called contact sites are formed by protein complexes spanning the two membranes (Figure 1). It is thought that these interaction sites are essential for cell viability due to their importance for the regulation of mitochondrial dynamics and inheritance, as well as the transfer of metabolites and signals between the cytosol and the matrix8.
The MICOS complex in the mitochondrial inner membrane is probably the best characterized and the most versatile contact site-forming complex. MICOS was described in yeast in 2011, and it consists of six subunits9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12, and Mic10. These form a complex of approximately 1.5 MDa that localizes to the crista junctions9,10,11. The deletion of either core subunit, Mic10 or Mic60, leads to the absence of this complex9,11, meaning these two subunits are essential for the stability of MICOS. Interestingly, MICOS forms not only one but multiple contact sites with various mitochondrial outer membrane proteins and complexes: the TOM complex11,12, the TOB/SAM complex9,12,13,14,15,16, the Fzo1-Ugo1 complex9, Por110, OM4510, and Miro17. This strongly indicates that the MICOS complex is involved in various mitochondrial processes, such as protein import, phospholipid metabolism, and the generation of the mitochondrial ultrastructure18. The latter function is probably the major function of&#160;MICOS, as the absence of the MICOS complex induced through the deletion of MIC10&#160;or MIC60&#160;leads to an abnormal mitochondrial ultrastructure that virtually completely lacks regular cristae. Instead, internal membrane vesicles without connection to the inner boundary membrane accumulate19, 20. Importantly, MICOS is conserved in form and function from yeast to&#160;human21. The association of mutations in MICOS subunits with severe human diseases also emphasizes its importance for higher eukaryotes22,23. Although MICOS is highly versatile, additional contact sites must exist (based on our unpublished observations). Indeed, several other contact sites have been identified, for instance, the mitochondrial fusion machineries Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26&#160;or Mdm31-Por1, which is involved in the biosynthesis of the mitochondrial-specific phospholipid cardiolipin27. Recently, we improved the method that led us to the identification of MICOS to identify Cqd1 as part of a novel contact site formed with the outer membrane complex Por1-Om1428. Interestingly, this contact site also seems to be involved in multiple processes such as mitochondrial membrane homeostasis, phospholipid metabolism, and the distribution of coenzyme Q28,29.
Here, we used a variation of the previously described fractionation of mitochondria9,30,31,32,33. Osmotic treatment of mitochondria leads to the disruption of the mitochondrial outer membrane and to a shrinkage of the matrix space, leaving the two membranes only in close proximity at contact sites. This allows for the generation of vesicles that consist exclusively of mitochondrial outer membrane or mitochondrial inner membrane or at contain contact sites of both membranes through mild sonication. Due to the mitochondrial inner membrane possessing a much higher protein-to-lipid ratio, mitochondrial inner membrane vesicles exhibit a higher density compared to mitochondrial outer membrane vesicles. The difference in density can be used to separate the membrane vesicles through sucrose buoyant density gradient centrifugation. Thus, the mitochondrial outer membrane vesicles accumulate at low sucrose concentrations, while the mitochondrial inner membrane vesicles are enriched at high sucrose concentrations. The vesicles containing contact sites concentrate at intermediate sucrose concentrations (Figure 2). The following protocol describes this improved method, which requires less specialized equipment, time, and energy compared to our previously established one32, in detail and provides a useful tool for the identification of possible contact site proteins.

تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن مواقع الاتصال بالميتوكوندريا والرؤى المعمارية 

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

We aim to understand the molecular function of mitochondrial contact sites, allowing the communication between the two mitochondrial membranes. This actually is a prerequisite to grasp the function for mitochondrial biogenesis and thus, cell viability. We discovered a new contact site between the mitochondrial inner and outer membrane created by Cqd1 and Om14-Por1.Our data suggests that this site might assist in lipid import like phosphatidic acid. Based on the identification of the MICOS complex, we contributed to get a deeper understanding of how mitochondrial membrane architecture is generated. This allowed us to develop a working model that explains how the two forms of mitochondrial cristae, lamellar and tubular cristae are formed.Our research was done in yeast in the past. However, we are convinced that the formation of correct mitochondrial architecture is important for higher eukaryotes too. So the next step in our research is analyzing the role of mitochondrial architecture elements in more complex models such as primary neurons.

من السهل نسبيا فصل الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن توليد وفصل الحويصلات المحتوية على موقع الاتصال أكثر صعوبة. في رأينا ، هناك خطوتان حاسمتان وضروريتان: شروط الصوتنة والتدرج المستخدم.
عادة ، يعتقد أن التدرجات الخطية لها دقة أفضل مقارنة بتدرجات الخطو?...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights at JoVE.com

مواقع ملامسة الميتوكوندريا هي مجمعات بروتينية تتفاعل مع بروتينات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. هذه المواقع ضرورية للتواصل بين أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي بين السيتوسول ومصفوفة الميتوكوندريا. نصف هنا طريقة لتحديد المرشحين المؤهلين لهذه الفئة المحددة من البروتينات.

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

نهدف إلى فهم الوظيفة الجزيئية لمواقع ملامسة الميتوكوندريا ، مما يسمح بالاتصال بين غشاءي الميتوكوندريا. هذا في الواقع شرط أساسي لفهم وظيفة التكوين الحيوي للميتوكوندريا وبالتالي صلاحية الخلية. اكتشفنا موقع اتصال جديد بين الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا الذي أنشأه Cqd1 و Om14-Por1.تشير بياناتنا إلى أن هذا الموقع قد يساعد في استيراد الدهون مثل حمض الفوسفاتيديك. استنادا إلى تحديد مجمع MICOS ، ساهمنا في الحصول على فهم أعمق لكيفية إنشاء بنية غشاء الميتوكوندريا. سمح لنا ذلك بتطوير نموذج عمل يشرح كيفية تشكيل شكلي cristae الميتوكوندريا ، cristae الصفائحي والأنبوبي.تم إجراء بحثنا في الخميرة في الماضي. ومع ذلك ، نحن مقتنعون بأن تكوين بنية الميتوكوندريا الصحيحة مهم لحقيقيات النوى العليا أيضا. لذا فإن الخطوة التالية في بحثنا هي تحليل دور عناصر بنية الميتوكوندريا في نماذج أكثر تعقيدا مثل الخلايا العصبية الأولية.

an-improved-method-to-isolate-mitochondrial-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

1.0K Views.  Ludwig-Maximilians University Munich. نهدف إلى فهم الوظيفة الجزيئية لمواقع ملامسة الميتوكوندريا ، مما يسمح بالاتصال بين غشاءي الميتوكوندريا. هذا في الواقع شرط أساسي لفهم وظيفة التكوين الحيوي للميتوكوندريا وبالتالي صلاحية الخلية. اكتشفنا موقع اتصال جديد بين الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا الذي أنشأه Cq...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن مواقع الاتصال بالميتوكوندريا والرؤى المعمارية 

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Generating Submitochondrial Vesicles from Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Generating Submitochondrial Vesicles from  Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites  

To begin, take 10 milligrams of freshly-isolated crude yeast mitochondria and re-suspend them in 1.6 milliliters of SM buffer at four degrees celsius by pipetting. Then, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cooled 100-milliliter Erlenmeyer flask. Slowly, add 16 milliliters of the swelling buffer, using a 20-milliliter glass pipette while applying constant mild stirring on ice.Incubate the samples under constant mild stirring for 30 minutes on ice. Then, slowly add five milliliters of 2.5-molar sucrose solution using a five-milliliter glass pipette, allowing the inner membrane to shrink. Incubate the samples under mild stirring for 15 minutes on ice.To generate sub-mitochondrial membrane vesicles, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cool rosette cell, and sonicate the suspension at 10%amplitude for 30 seconds while cooling the rosette cell in an ice bath. Rest the suspension for 30 seconds in an ice bath.

توليد حويصلات تحت الميتوكوندريا من Saccharomyces cerevisiae Mitochondria لعزل مواقع الاتصال بالميتوكوندريا

Separation and Analysis of Submitochondrial Vesicles to Identify Mitochondrial Contact Site Proteins

To begin, take the prepared yeast sub-mitochondrial vesicles and centrifuge the generated vesicles and remaining intact mitochondria at 20, 000 G for 20 minutes at four degrees Celsius. The intact mitochondria formed the pellet while the vesicles stay in the supernatant. Next, transfer the supernatant to fresh ultra centrifugation tubes.Load a cushion of 0.3 milliliters of 2.5 molar sucrose solution at the bottom of the tube using a one milliliter syringe equipped with a cannula, and centrifuge at 118, 000 G for 100 minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, the vesicles will appear as a disc on the top of the sucrose cushion. Discard approximately 90%of the supernatant.To harvest the concentrated vesicles, resuspend them in the remaining buffer, including the 2.5 molar sucrose by pipetting. Transfer the suspension to an ice cold Dounce homogenizer and homogenize the suspension using a polytetrafluoroethylene potter with at least 10 strokes. Next, prepare an 11 milliliter step gradient with each layer containing 2.2 milliliters of sucrose solution.Calculate the sucrose concentration using this formula. Add the highest sucrose concentration to the centrifugation tube and place it at minus 20 degrees Celsius until the layer is completely frozen. Measure the sucrose concentration of the samples using a refractometer.If a refractometer is unavailable, assume the sucrose concentration is 2 molar. To adjust the sucrose concentration to 0.6 molars, add the appropriate MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F, and protease inhibitor cocktail at pH 7.4. Carefully load the samples on the sucrose gradient to avoid the disturbance of the gradient.Centrifuge the vesicles at 200, 000 G and four degree Celsius for 12 hours. If possible, set slow acceleration and deceleration to avoid disruption of the gradient. Then harvest the gradient from top to bottom in 700 microliters fractions, using a one milliliter pipette.Resulting in 17 fractions, which provides a sufficient resolution. Next, perform two sequentially executed trichloroacetic acid precipitations by adding 200 microliters of 72%trichloroacetic acid to the individual fractions and mixing until the solution is homogeneous. Incubate the fractions for 30 minutes on ice and pellet the precipitated proteins by centrifuging at 20, 000 G and four degrees Celsius for 20 minutes.Discard the supernatant. Add 500 microliters of 28%trichloroacetic acid solution. Mix well and repeat the centrifugation step.Finally, analyze the fractions by SDS-PAGE and immunoblotting. The importance of mild sonication is presented here. The mitochondrial outer membrane marker Tom40 was enriched in the early low density fractions and was virtually absent in the later ones.The mitochondrial inner membrane marker Tim17 was concentrated in high density fractions. In contrast, the contact site protein Mic60 accumulated infractions of intermediate sucrose concentration, indicating the successful generation and subsequent separation of the various membrane vesicles. In contrast, with harsher sonication conditions, the mitochondrial outer membrane marker Tom40 could be detected in lower fractions of the gradient.Additionally, there was a significant amount of Tim17 infractions of intermediate density.