للبدء ، خذ ملليلترا واحدا من مزرعة خلايا الخميرة الناشئة في منتصف الطور ، معبرا عن HyPer7 الذي يستهدف الميتوكوندريا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 6،000 غرام لمدة 30 ثانية ، وإزالة طاف ، وترك 10 إلى 20 ميكرولتر في الأنبوب. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق مزجها برفق مع الوسائط المتبقية باستخدام ماصة دقيقة.
بعد ذلك ، استخدم منفاخ هواء أو منديلا خاليا من النسالة لتنظيف شريحة مجهر زجاجية ، وأضف 1.8 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الشريحة. أخيرا ، قم بتغطية الخلايا بغطاء زجاجي رقم 1.5 عن طريق خفضه ببطء بزاوية لتجنب إدخال فقاعات. ثم ضع الشريحة على مرحلة المجهر.
لتصوير الخلايا ، قم بإعداد شروط الاستحواذ لضمان إشارة قابلة للكشف ودقة مقبولة في كل قناة مضان. على سبيل المثال ، على مجهر متحد البؤر للقرص الدوار مع كاميرا sCMOS ، استخدم 2x2 binning ، و 20 إلى 40٪ من طاقة الليزر ، والتعرض من 200 إلى 600 مللي ثانية. بعد ذلك ، افحص الرسم البياني للصورة.
في صورة 12 بت ، تأكد من أن النطاق الديناميكي الإجمالي لقيم البكسل لا يقل عن عدة مئات من المستويات الرمادية دون تشبع. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من أن النطاق أعلى بترتيب واحد من مستوى الضوضاء. لحساب مستوى التشويش، قم بقياس الانحراف المعياري لقيم البيكسل في مساحة خالية من الخلايا من الصورة.
ثم اجمع صور الفاصل الزمني دون تأخير بين عمليات الاستحواذ لتقييم آثار ظروف التصوير على استقرار الإشارة والإجهاد التأكسدي في الميتوكوندريا. باستخدام برنامج الحصول على المجهر أو ImageJ ، قم بقياس متوسط قيمة البكسل في كل قناة مضان لضمان استقرار الإشارة. إذا كانت التجربة لا تتضمن تصويرا بفاصل زمني ، فتأكد من أن التألق مستقر على اثنين أو ثلاثة من مكدسات Z المتكررة.
احصل على صور بفاصل Z يبلغ 0.5 ميكرومتر في عمق مكدس إجمالي يبلغ ستة ميكرومتر للخميرة الناشئة. في حالة تجميع مكدسات Z ، تأكد من أن الفاصل الزمني Z هو نفسه لجميع الصور في مجموعة البيانات وقم بتضمين الخلية بأكملها. احصل أيضا على صور ضوئية مرسلة لتوثيق حدود الخلايا.
