للبدء ، افتح صورة مكدس Z متعددة القنوات في فيجي ، وافتح ملف البرنامج النصي لتحليل المستشعر الحيوي المطلوب. انقر فوق تشغيل في نافذة محرر البرامج النصية لتشغيل البرنامج النصي. ثم أدخل المعلومات المطلوبة في نافذة الحوار التي تظهر.
حدد أرقام قنوات البسط والمقام لحساب النسبة. بالنسبة للميتوكوندريا المستهدفة HyPer7 ، فإن البسط هو القناة المثارة عند 488 نانومتر والمقام هو القناة المثارة عند 405 نانومتر. حدد رقم القناة للصورة الضوئية المرسلة إذا كانت موجودة ، أو صفر إذا لم يكن هناك شيء.
ثم اختر طريقة طرح الخلفية المطلوبة. إذا كانت الخلفية موحدة، انقر تحديد منطقة صورة لقياس مستوى الخلفية في الصورة. بعد ذلك ، اختر طريقة طرح الضوضاء المطلوبة لتقليل الاختلاف العشوائي في قراءات الكاشف.
انقر على تحديد منطقة صورة. حدد خيار القيمة الثابتة لإدخال مستوى ضوضاء تم قياسه مسبقا ، والذي يعمل عادة بشكل جيد إذا ظلت ظروف التصوير ثابتة. للكشف الدقيق والمتسق عن الميتوكوندريا، حدد خوارزمية عتبة مثل Otsu أو الحد الأقصى للإنتروبيا.
استخدم نفس الخوارزمية لجميع الصور في التجربة ، ولكن تأكد من التعرف على الميتوكوندريا بدقة. ثم حدد عدد مناطق الاهتمام لكل خلية. على سبيل المثال ، في حالة قياس اختلافات البراعم الأم ، حدد اثنين.
حدد مجلد الإخراج حيث سيتم حفظ القياسات وصور النسبة. لتصحيح الخلفية أو التشويش، اختر تحديد منطقة صورة. اتبع المطالبات لرسم منطقة خلفية باستخدام أداة عائد الاستثمار المستطيل وانقر فوق موافق.
أثناء تحليل الخلايا الفردية أو المناطق تحت الخلوية ، ارسم مناطق الاهتمام بناء على صورة برايتفيلد. لا يحتاج عائد الاستثمار إلى مطابقة مخطط الخلية بدقة حيث سيتم قياس الميتوكوندريا العتبة فقط ضمن عائد الاستثمار. بعد إنشاء كل عائد استثمار، اضغط على T لإضافة عائد الاستثمار المحدد إلى مدير عائد الاستثمار.
حدد إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار لتوثيق الخلايا التي تم وضع علامة عليها. ستظهر كل منطقة مضافة كعنصر مرقم في قائمة مدير عائد الاستثمار. في حالة تحليل أكثر من عائد استثمار واحد لكل خلية، حدد عائد الاستثمار بنفس الترتيب لكل خلية تم تحليلها.
بعد إضافة جميع عائد الاستثمار المطلوب إلى مدير عائد الاستثمار ، انقر فوق حسنا في نافذة الحوار وضع علامة على الخلايا. بعد ذلك ، حدد تنسيق جدول القياس. في نافذة الحوار متعدد القياسات، تحقق من خيارات قياس كل الشرائح وصفا واحدا لكل شريحة لإنتاج جدول بالتنسيق المطلوب.
استخدم جداول عائد الاستثمار المتعددة للعملية. rscript لمعالجة الجداول التي تم إنشاؤها باستخدام خيار صف واحد لكل شريحة. لا تتحقق من خيار إلحاق النتائج.
احفظ ملفات الإخراج في المجلد المحدد باستخدام البرنامج النصي. افتح الآن صورة مكدس النسبة Z في فيجي لإنشاء صورة نسبة ملونة. ثم افتح colorize_ratio_image.
ijm script file وانقر فوق تشغيل في نافذة محرر البرامج النصية. ستظهر نافذة حوار تطالب بإدخال المعلومات المطلوبة. في الخيار غير المعدل ، تظهر جميع وحدات بكسل الميتوكوندريا بنفس السطوع.
قد تظهر بعض الصور صاخبة حيث تساهم وحدات البكسل الخافتة والساطعة في نسبة الصورة. استخدم خيار تعديل الشدة لتقليل الضوضاء. في طريقة القيم المعروضة الدنيا والقصوى، اختر قيما بالقرب من متوسط القيم الدنيا والقصوى التي تمت ملاحظتها في تجربة.
لضمان الاتساق ، احصل على جميع الصور باستخدام نفس ظروف التصوير واعرض جميع الصور باستخدام نفس القيم الدنيا والقصوى. ثم حدد وضع الإسقاط لعرض مكدس Z وإظهار مجموعة الميتوكوندريا بالكامل قبل التلوين. للحصول على أقصى إسقاط للكثافة، حدد الحد الأقصى.
لإنشاء إسقاط متوسط الكثافة، حدد المتوسط. أخيرا ، حدد المجلد لحفظ الصور الملونة. إذا كان الخيار غير المعدل محددا، اختر نظام ألوان في نافذة الحوار التي تظهر.
استخدم جداول بحث RGB الخاصة بالنار أو قوس قزح المضمنة في فيجي أو أي جدول بحث مرغوب فيه بتنسيق LUT الخاص ب ImageJ. استخدم البرنامج النصي لحفظ ملفات الإخراج في المجلد المحدد. أظهرت النسبة المختزلة المؤكسدة للميتوكوندريا الموسومة HyPer7 استجابة تعتمد على الجرعة لتركيز بيروكسيد الهيدروجين ، والتي وصلت إلى هضبة عند واحد إلى اثنين من المليمولار يضاف بيروكسيد الهيدروجين خارجيا.
لوحظت اختلافات في بيروكسيد الهيدروجين الميتوكوندريا داخل خلايا الخميرة. تم الكشف عن انخفاض معتد به إحصائيا في قراءات المستشعر الحيوي لبيروكسيد الهيدروجين في الميتوكوندريا في مهدها مقارنة بالخلية الأم.
