Lentiviral Packaging and Viral Titering for Genome-Scale shRNA Screens

في يوم الصفر لوحة 10 ملايين 293T الخلايا في 30 ملليلتر من DMEM خالية من المضادات الحيوية تحتوي على 10 ٪ FBS في طبق 15 سم. إعداد ما مجموعه 10 من هذه الأطباق. في اليوم التالي ، وهو اليوم الأول ، تأكد من أن الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ وجاهزة للنقل.

ثم في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر بالتتابع ، أضف 600 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من مزيج البلازميد للتغليف و 60 ميكرولتر مكتبة الباركود البلازميد. في أنبوب مخروطي منفصل 15 ملليلتر ، يخلط 900 ميكرولتر من كاشف النقل و 12 ملليلتر DMEM عن طريق الدوامة. أضف 12.9 ملليلترا من هذا الخليط إلى مزيج الحمض النووي (DNA) وانقر فقط للاندماج.

دون خلط أكثر من ذلك ، احتضان المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم أضف 2.5 ملليلتر من الخليط المحتضن إلى كل طبق 15 سم يحتوي على خلايا 293T واحتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة. في اليوم الثالث ، احصد الفيروس عن طريق تمرير الوسائط عبر وحدة ترشيح 0.2 ميكرون.

Aliquot المرشح الذي يحتوي على جزيئات فيروسية في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد خمسة حصص سعة 1 ملليلتر من الفيروس المصفى في قوارير التبريد للمعايرة الفيروسية. لمعايرة برك الفيروسات العدسية ، أضف 65 ميكرولترا من البوليمر الموجبة إلى دورق زجاجي معقم يحتوي على 65 ملليلتر من وسائط نمو الخلايا السرطانية.

ماصة ملليلتر واحد من البوليمر الذي يحتوي على وسائط لكل بئر في 11 لوحة زراعة الأنسجة ستة آبار. التربسين التالي الخلايا السرطانية المرور المبكر. بعد عد الخلايا باستخدام طريقة مفضلة ، انقل الخلايا إلى ألواح الآبار الستة.

قم بإذابة حصص المليلتر الواحد من فيروس lentivirus لمدة 48 ساعة من الفريزر في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. اتبع الجدول لإعداد العدوى لكل وحدة فيروسية.