Ex Vivo Calcium Imaging of Flat-Mounted Rat Retina upon Electrical Stimulation

ضع GCaMP 5G الذي يعبر عن شبكية عين الفئران المثبتة على MEA مع مواجهة GCL للأقطاب الكهربائية على مرحلة المجهر. قم بتوصيل نظام التروية واضبط المعلمات لتغذية حمام العينة باستمرار باستخدام وسيط AMS المؤكسج. بعد ذلك ، افحص شبكية العين باستخدام مجهر مضان مقلوب مزود بمصباح فلورسنت ومرشح FITC وكاميرا CMOS.

ابحث عن منطقة تظهر فيها الأقطاب الكهربائية المحفزة والتألق من خلايا التعبير عن GCaMP. في برنامج أجهزة مولد النبضات ، قم بتكوين معلمات التحفيز الكهربائي مثل الشكل والسعة والمدة وتأخير الطور وتكرار النبضات للتطبيق. قم بتوصيل الكاميرا بمولد النبضات باستخدام إشارة تشغيل الإخراج واضبط وضع التقاط برنامج الكاميرا على مشغل بدء خارجي.

اضغط على زر البدء في برنامج الكاميرا بحيث ينتظر مشغل خارجي للبدء. ابدأ عملية الحصول على الصور باستخدام برنامج مولد النبض واحفظ الصور الملتقطة ، مع التأكد من أن اسم الملف يتضمن جميع معلمات التحفيز الكهربائي المطبقة. افتح الآن الصورة J وقم بتقسيم منطقة الاهتمام باستخدام أدوات تحديد المنطقة ، وأضفها إلى مدير عائد الاستثمار ، واحفظها كمجلد مضغوط باستخدام قائمة مدير عائد الاستثمار.

استخرج متوسط القيمة الرمادية من somas الخلية بالانتقال إلى المزيد والنقر فوق القياس المتعدد. قم بتمكين خيارات قياس جميع الشرائح ال 600 وصفا واحدا لكل شريحة للحصول على جدول واحد تتوافق فيه الأعمدة مع عائد الاستثمار والصفوف مع الأطر الزمنية. ثم استخرج النقطه الوسطى من عائد الاستثمار باستخدام أمر القياس.

لتصحيح تأثير تبييض الصورة وتقليل الخلفية ، حدد ما يقرب من 15 إلى 20 إطارا من الفواصل الزمنية غير المحفزة قبل كل تتابع وقم بتركيب هذه الإطارات في منحنى خطي لضمان التحليل الأمثل للبيانات. يتم عرض آثار الكالسيوم لسوما الخلية على خمس دفعات من قطارات النبض كل 10 ثوان خلال التقاط صورة مدتها 60 ثانية. يتم استخدام إطارات من الفترات غير المحفزة لتصحيح تأثير تبييض الصورة.

أظهرت العلاقة بين التيار المطلوب لتنشيط الخلايا والمسافة من القطب المحفز أن الخلايا الواقعة بالقرب من القطب المنجذب تتطلب قيم تيار أقل لإثارة استجابة.